2015 Fiscal Year Research-status Report
高い形質転換効率をもつシアノバクテリアによる新規光依存型酵素の創成
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26660084
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
藤田 祐一 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (80222264)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | シアノバクテリア / 形質転換 / プロトクロロフィリド還元酵素 / 進化分子工学 / クロロフィル生合成 / 強光適応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
光依存型プロトクロロフィリド還元酵素（LPOR）は、プロトクロロフィリドのC17=C18二重結合を立体特異的に還元し、クロロフィルaの直接の前駆体クロロフィリドaを生成する反応を触媒する。触媒作用の駆動に光を利用するLPORは、新たな光依存型酵素の鋳型として利用できる可能性を秘めている。本研究では、シアノバクテリアLeptolyngbya boryanaのLPORの光依存的な反応に重要であると推定される構造に対応する遺伝子領域を、終止コドンを含まないセミランダムなDNA配列に置換したライブラリーを構築し、これを自発的な形質転換能を持つシアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803の形質転換効率を向上させたLPOR欠損株（por-recJ欠損株；LPOR欠損により強光感受性を示し、recJ欠損により形質転換効率が上昇している）を宿主として、強光耐性付与を指標として選抜することで新規LPOR（活性型新規LPOR）の創出を目指す。前年度は、por-recJ欠損株を強光下で選抜する際に無視できない効率で出現する偽復帰変異株（PR株）の出現頻度が最小限となる条件で選抜された強光耐性株10株を単離した。今回、それらの株を詳細に分析したところ、強光耐性は新規LPORの創成によってもたらされたものではなくゲノム上の別の変異によって生じたことがわかった。これらの株のゲノムリシーケンスにより全株に共通する５つの変異が見つかり、用いたpor-recJ欠損株が選抜以前にこれらの変異を有していたことが示唆された。これらの変異のうち1つのSNPの存在がPR株の生成をもたらす可能性が高いと考え、一旦このSNPをもつ遺伝子の完全欠損を単離しこれにpor-recJ欠損を新たに導入し、PR株の出現頻度をより低下させた宿主を用いて新規LPORのスクリーニングを行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
強光耐性を指標とした選抜において偽復帰変異株（PR株）の出現が効率的な新規LPORの妨げとなっているため、PR株の出現頻度が最小になるような、形質転換とその後の選抜条件を確立し、選抜を行った。しかし、得られた強光耐性株はすべてPR株であり、それらのゲノムには共通して５つのSNPが存在することがわかった。このため、さらにPR株の出現頻度をさらに低減させた新たな宿主を単離する必要が生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
偽復帰変異の出現を最小限とするための新たな宿主を単離しなおす。偽復帰変異の原因となるSNPをもつ遺伝子の全域を欠失させた株を親株として新たにpor-recJ欠損を導入して新たな選抜用の宿主を単離する。並行して、シアノバクテリアの有するLPORと最も高い類似性を示す機能未知のLPOR様タンパク質をコードする遺伝子を原型として、必要とされるループ部分を置換することでLPORのプロトタイプの酵素が創出できるかどうかという別のアプローチから新たなLPOR創出を進める。
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| Causes of Carryover |
研究進捗に記載したように、強光耐性株の選抜時において想定以上の偽復帰変異が生じることがわかり、その原因の究明等が新たな課題となったため、計画通りの研究費使用ができなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度では、新たな宿主株の単離後、本格的なスクリーニングに要する合成DNAの購入などの新たな研究方針に基づいて次年度使用額を効率的に利用する予定である。
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[Journal Article] Transformation of the cyanobacterium Leptolyngbya boryana by electroporation2015
Author(s)
Tsujimoto, R., Kotani, H., Nonaka, A., Miyahara, Y., Hiraide, Y. and Fujita, Y.
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Journal Title
Bio-Protocol
Volume: 5
Pages: e1690
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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