2016 Fiscal Year Research-status Report
高い形質転換効率をもつシアノバクテリアによる新規光依存型酵素の創成
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26660084
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
藤田 祐一 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (80222264)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | シアノバクテリア / 形質転換 / プロトクロロフィリド還元酵素 / 進化分子工学 / クロロフィル生合成 / 強光適応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
光依存型プロトクロロフィリド還元酵素（LPOR）は、プロトクロロフィリドのC17=C18二重結合を立体特異的に還元し、クロロフィルaの直接の前駆体クロロフィリドaを生成する。光が触媒作用を駆動するLPORのユニークな性質から、LPORが新たな光依存性酵素の鋳型として利用できる可能性を秘めている。本研究では、LPORの光依存的な反応に重要と推定されるドメインに対応する遺伝子領域を、終止コドンを含まないセミランダムなDNA配列に置換したライブラリーを構築し、自発的な形質転換効率を大幅に向上させたLPOR欠損シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803（por-recJ欠損株：LPOR欠損により強光感受性を示し、recJ欠損により形質転換効率が上昇している）を宿主とし、強光耐性付与を指標として選抜を行い、新規LPORの創出を目指している。LPOR欠損による強光感受性の相補（強光耐性）を指標として新規LPORをスクリーニングする過程で、偽復帰変異株（Pseudorevertant; PR株）が高頻度で出現することが大きな妨げとなることが明らかになった。PR株のゲノムリシーケンスの結果slr2031のSNP（1塩基置換）が高頻度で共通に生じることが判明した。このことは、宿主として用いているpor-recJ株の一部にこのSNPを有する細胞集団が存在することを示唆する。そこで、slr2031が完全に欠失した株からpor-recJ欠損を導入し、por-recJ-slr2031株を単離した。この株は、これまでのpor欠損、recJ欠損、por-recJ欠損と比べて光感受性が高まることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新たなLPOR生成を強光耐性を指標としてスクリーニングを行ったが、高頻度のPR株の出現が新規LPORをもつ形質転換体同定の妨げとなってきた。
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| Strategy for Future Research Activity |
新たに強光耐性PR株の出現頻度を下げるためにslr2031欠損を加えたpor-recJ-slr2031株を単離した。今後、この株を新たな選抜宿主として新たなスクリーニングを展開する。
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| Causes of Carryover |
新規LPORのスクリーニングの過程で、強光耐性を示す偽復帰変異株（PR株）が高頻度に出現することが大きな妨げとなっていることが明らかとなった。いくつかのPR株のゲノムリシーケンスの結果、slr2031に共通のSNPを有することが判明した。このことは、宿主として用いた親株（por-recJ株）にもともと強光耐性を示すslr2031のSNPをもつ細胞集団が含まれていることが示唆された。そこで、新たにpor-recJ-slr2031三重欠損株の単離を行ったため、予定年度内に研究を終了することが困難となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
新たに単離したpor-recJ-slr2031株を宿主として、新規LPORのスクリーニングを行う。本株を用いたスクリーニングで得られた強光耐性株のセミランダムDNA断片の導入箇所の塩基配列決定とゲノムリシーケンスにより、新規酵素の創出を確認する。
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