2016 Fiscal Year Annual Research Report
Biochemical preparation of isotpe-labelled lipopolysaccharide and nmr analysis of host recognition mechanism of phage
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26660085
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
稲垣 穣 三重大学, 生物資源学研究科, 教授 (20242935)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | リポ多糖 / R-コア糖鎖 / galE遺伝子 / 欠損株 / 相同組み換え / DOC-PAGE / ＬＣ－ＭＳ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
大腸菌C株の合成するリポ多糖に外部から13Cの同位体標識を施したガラクトースを取り込ませるため，UDPガラクトースエピメラーゼ遺伝子galEを欠損させた変異株の作成を検討した。H28年度は，galE遺伝子をゲノムからPCRで増幅し配列をついに決定することができた。これまでゲノム遺伝子配列が知られている大腸菌K-12 W3110株の配列と1塩基が異なるが，アミノ酸配列は同じであった。
また，大腸菌F2513株のLPS生合成のための糖転移酵素のうち，R-コアの非還元末端の二つのガラクトース残基を転移するwaaWとwaaT遺伝子を特定して，λファージリコンビナーゼ活性を活用するDachenkoらの方法を用いて，これらの遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子と相同組み換えを行って欠損させた変異株F2513ΔwaaWおよびΔwaaT株の作出に成功した。ただし，これらの変異株は，抗生物質を含む寒天培地上でゆっくり増殖するものの，液体培地ではきわめて生育が遅く，そこからLPSを取り出すまでに増菌せず，LPSの糖鎖構造の確認に至っていない。
大腸菌K-12株のR-コア非還元末端にL-グリセロ-D-マンノヘプトース(Hep)を転移するwaaU遺伝子を保持したASKA(-)クローンJW3598-AM株を国立遺伝学研究所から分譲を受け，そのWaaU酵素を含むタンパク質分画を調製し，ネズミチフス菌(Salmonella)のR-コアの非還元末端の糖残基を欠いたLPSを生合成する変異株SL733に対して作用させたところ，少量ではあるが，サルモネラ菌のLPSの末端にHep残基が取り込まれたことを単離したLPSがDOC-PAGEによって泳動度が低下したバンドを与えたこと，およびLPSの酸加水分解物PSのLC-ESI-IT-MSにより目的の糖鎖に一致するイオンをSIM測定で確認することができた。
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