セルロースを使った雪腐病菌の巧みな生存戦略の解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26660092
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 今井 亮三 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 北海道農業研究センター寒地作物研究領域, 上席研究員 (90291913)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: セルロース / 糸状菌 / 雪腐病菌

Outline of Annual Research Achievements

１．候補遺伝子（MN10258）の単離と発現解析
Hsiang教授より提供されたM. nivale CelA様遺伝子MN10258のゲノム配列を基に，セルロース誘導（低温）条件で培養した菌体よりRNAを抽出し，ゲノム配列よりプログラムで予想された推定ORF配列を基にプライマーを設計し，RT-PCRにより全長cDNAを単離した．それぞれMnCSL1, MnCSL2と命名した．
２．MN10258遺伝子のセルロース生合成活性の解析
AgrobacteriumのcelA変異株の作出に成功した．下記にあるように，M. nivaleの形質転換系の開発に成功したことから，Agrobacterium変異体を利用した生合成活性の解析は中止した．
３．MN10258遺伝子破壊株の作出および機能性解析
M. nivaleの形質転換系の報告はこれまでになかったが，Agrobacteriumを用いた手法でGFPレポーター遺伝子をM. nivaleに導入することに成功した．CSL2遺伝子の破壊株の作出に成功した．CSL1についても破壊株の作出を継続している．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画した3つの研究項目のうち項目1については予定通り達成された．項目3については順調に進捗している．項目2のAgrobecterium変異体を利用した活性測定については，M.nivale変異体を使う直接的な機能解析に目処がついたため，一旦中止とした．

Strategy for Future Research Activity

３．MN10258遺伝子破壊株の作出および機能性解析
MnCSL破壊株について，低温環境下で菌体外に分泌するセルロースを調査する．また，TAD1を組換え大腸菌より精製し，破壊株に対して処理する．TAD1処理によるセルロース分泌の誘導が喪失されていることをCongo-red 染色等を用いて明らかにする．MnCSL遺伝子破壊株を用いて，TAD1に対する感受性を調べる．セルロース欠損により，TAD1に対する感受性が高まっていることが予想される．また，セルロース欠損によりコムギに対する病原性の変化を葉身への胞子接種試験等により明らかにする．

Causes of Carryover

CSL1, CSL2遺伝子の単離および，M. nivaleの形質転換系の確立が，予想に反してスムーズに進んだため．

Expenditure Plan for Carryover Budget

CSL1,CSL2以外の候補遺伝子解析のため次世代シーケンス解析を行う．また，解析に必要な研究支援人材を雇用する．