マイクロチャネルを用いるin vitroカロース中空ファイバー生産モデル系の構築

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26660146
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 近藤 哲男 九州大学, 農学研究院, 教授 (30202071)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: カロース / カルス / プロトプラスト / 中空ファイバー生産 / マイクロチャネル

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、「酸性下で大過剰のカルシウムイオンを添加した系でカルスプロトプラストを培養すると、細胞外に、ナノサイズの中空糸が束となったマイクロサイズ幅（14μm）のカロース（β-1,3-グルカン）巨大繊維を生産・噴出する」という研究代表者らが見出した現象のモデル系を構築し、さらに植物ナノ繊維化の半人工プロセスの提案へと挑戦するものである。
既報に従って、I字型マイクロ流体デバイスを作成した。I字型マイクロ流体デバイスの流路の途中に切り込みを入れ、40μm経のポリエチレン製メッシュを挟み込んだ。シラカンバの葉柄由来のカルスからプロトプラストを調製し、マイクロマニピュレーターを用いてマイクロ流体デバイス内にそれらを導入・固定し、反応バッファーをそのデバイス内に流すことにより、カロース生産を試みた。
分取した液をaniline blue fluorochromeで染色し、蛍光顕微鏡観察へ供するとともに、1 %で負染色しTEM観察へ供した。蛍光顕微鏡観察では、すべての流速で緑色蛍光を発する膜状の物質が観察された。蛍光顕微鏡で観察された膜状の物質はカロースの凝集物、もしくは流している途中で脱離した微小な細胞膜片に合成されたカロースが堆積されたものだと考えられる。TEM観察では、幅が数十μmのリボン状のファイバーが観察された。現在、生産物がカロースであるか確認するための免疫抗体染色の条件検討を行っている。
以上の結果は、本研究で、マイクロチャネルを用いるデバイスで、カロース生産モデル系を実現させることができる可能性を示したことになる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画で、「平成26年度から27年度の2年以内にデバイスの完成を目指す」とあり、それに向かって成果は順調にあがっている。
本研究は、植物ナノ繊維化の半人工プロセスの提案へと挑戦するものである。そのためのキーポイントは、マイクロチャネル流路にカロース合成複合酵素の役割の一部を担わせる点である。すなわち、マイクロチャネル流路とプロトプラストの合成酵素を含有した細胞断片（ゴースト）とを合体させたin vitro半人工デバイスの構築が最優先される。そのため、計画では、平成26年度から27年度の2年以内のデバイスの完成を目指している。
上記の点において、I字型だけではあるが、マイクロチャネル流路を作製し、流動場でコーストの固定を確認し、チャネルを通過した分取液中にカロースファイバー状断片が観察されたことは、半人工プロセス構築のための第一歩を踏み出したということができる。

Strategy for Future Research Activity

平成27年度は、研究計画にしたがって、Y字型チャネルを作製し、Y字の２分岐入路から２液を導入させる培養を試みる。この場合、層流になると溶液自体の混合は起きにくい。この層流がマイクロチャネルのリアクターとしての欠点とされている。
本課題においては、Y字型チャネルの場合は、この層流の場合と、層流ではなく流速を上げ乱流にして2液を混合しながら培養するという流路による二つの培養法を試みる。層流の場合、ネットワーク形成を抑制する働きをして、最終的に一方向に配向した、いくつかのナノファイバーが集積した繊維構造となる可能性もある。