2014 Fiscal Year Research-status Report
マウス及びウシ胚盤胞の休眠を誘導・長期間維持する体外培養法の開発
| Project/Area Number |
26660209
|
|---|
| Research Institution | Kyoto University |
|---|
Principal Investigator |
山田 雅保 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (10243073)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | マウス / ウシ / 胚盤胞 / 休眠 / 体外培養 / スレオニン / スレオニン脱水素酵素 / ヒストンH3K4トリメチル化 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
体外培養において、受精後5日目（day5）以降のマウス遅延着床胚盤胞を休眠状態で維持するには、培地へのスレオニン（Thr）の添加が必須であることを始めて明らかにしている。今年度は、体外培養マウス遅延着床胚盤胞のThrによる休眠の誘導・維持機構の解明と、マウス子宮内あるいは体外培養でのウシ胚盤胞の休眠誘導・維持方法の開発に取り組んだ。その成果を以下に挙げる。
（１）体外培養マウス遅延着床胚盤胞の内部細胞塊（ICM）にスレオニン脱水素酵素（TDH）が局在し、day9 まで発現していること、そしてThrのバリアントである3-Hydroxynorvaline（3-HNV）で遅延着床胚盤胞を処理すると、胚は萎縮変性し、過剰のThrを同時に添加するとその変性は阻止されることが分かった。従って、ThrがTDHによってグリシンとAcetyl-CoAに代謝されTCA回路を活性化するのに対し、3-HNVはTDHによってグリシンと TCA回路の活性に寄与しないpropionyl-CoAへと代謝されることから、マウス遅延着床胚盤胞の休眠維持が、ICMでのTDHによるThrの異化作用に依存していることが示唆された。（２）さらに、Thrの代謝により産生されるメチル基供与体であるSアデノシルメチオニンによるヒストンH3K4のトリメチル化の促進が重要な役割を果たしていることを示唆する結果も得られた。（３）体外受精後8日目のウシ胚盤胞を卵巣除去偽妊娠マウスの子宮に移植しても胚は変性し、マウス胚のように休眠は誘導されないことが明らかとなった。しかし、ウシ胚盤胞を10% FBS, 200uM 2メルカプトエタノール, 120uM メチオニン,10uM Y-27632そして1mM グルコースを添加したEDTA不含KSOM培地で培養すると、70%の胚が拡張胚盤胞として14日間維持できることが分かった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
体外培養マウス遅延着床胚盤胞の休眠の誘導・維持におけるスレオニン（Thr）の促進効果について、今年度は、マウス遅延着床胚盤胞の休眠の誘導・維持が内部細胞塊に局在するスレオニン脱水素酵素によるThrの異化作用に依存し、さらにヒストンH3K4のトリメチル化促進と関連していることを示唆する結果を得ることができたが、休眠の誘導・維持におけるオートファジー活性や小胞体ストレスの関与や細胞寿命延長作用が知られているresveratrolやポリアミンの効果について検討できなかった。しかし、卵巣除去偽妊娠マウス子宮内でウシ胚盤胞の休眠をマウス胚のようには誘導できなかったが、体外培養で、ウシ胚盤胞を拡張胚盤胞として高率にしかも長期間維持できることを初めて明らかにできた。従って、当初の計画とは異なるところもあるが、概ね順調に研究が進展していると判断される。
|
| Strategy for Future Research Activity |
（１）マウス遅延着床胚盤胞の体外培養での休眠誘導・維持に関する研究では、スレオニンの促進効果がヒストンH3K4のトリメチル化（ユークロマチン化）の促進と関連することから休眠誘導・維持において発現が促進される遺伝子をDNAマイクロアレイによって網羅的に調べ、その中から特定の遺伝子の関与を明らかにする。また、オートファジー活性や小胞体ストレスを調節することによってより長期間休眠を維持できる体外培養法を開発する。
（２）今年度開発した方法で拡張胚盤胞として長期間維持されるウシ胚盤胞が休眠状態で維持されているのかを、その胚のDNA合成と分裂活性、そして内部細胞塊と栄養膜細胞の機能的特徴を解析することによって明らかにする。
|
| Causes of Carryover |
マウス遅延着床胚盤胞の体外培養での休眠の誘導維持がスレオニンによって促進される。その促進機構の解明に関する研究おいて、休眠の誘導維持にヒストンH3K4のトリメチル化促進による遺伝子発現の促進が関与していることが示唆されたことから、スレオニン処理遅延胚盤胞で特異的に発現が促進される遺伝子をDNAマイクロアレイによって網羅的に解析する研究を次年度に行うことが必要となったために、この研究にかかる費用を次年度に繰り越した。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
スレオニン処理マウス遅延胚盤胞で特異的に発現が促進される遺伝子をDNAマイクロアレイによって網羅的に解析し、さらに休眠の誘導・維持に重要な遺伝子を特定する研究に繰り越した費用を使用する。
|
