2014 Fiscal Year Research-status Report
乳エキソソーム中のウイルス成分検出による農家単位での牛白血病診断手法の開発
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26660239
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
猪島 康雄 岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (20355184)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | エキソソーム / 生乳 / バルク乳 / 牛白血病 / 牛白血病ウイルス / 診断法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、タンクに集められた牛の生乳（バルク乳）からエキソソームを分離・精製し、牛白血病ウイルス(BLV)を検出、BLVの感染状況を農家単位で一括診断する手法の開発を目的とする。具体的には、以下の２点について研究を進める。
（１）牛の生乳から効率よくエキソソームを分離・精製する方法を確立する。
（２）バルク乳エキソソーム内のBLV成分（蛋白と核酸）を検出することにより、BLV感染状況を農家単位で全頭一括診断する手法を開発する。
本年度は、最初に、効率よく確実に乳エキソソームを分離・精製する方法の確立を検討した。非感染牛3頭からの生乳を用いて、ヒト・培養細胞用の市販エキソソーム分離キットによる乳エキソソームの分離を試みた。5種類の市販キットを用いて比較したところ、キットのプロトコール通りではいずれも乳エキソソームは分離できなかった。しかし、生乳中に多く含まれる脂肪球とカゼインを超遠心で取り除けば、乳エキソソーム分離にも利用できるキットがあることを明らかにした。次に、分離したエキソソーム量のウェスタンブロッティングによる評価系確立のために、ヒトエキソソームのマーカーとして知られている抗原を標的に、市販の抗牛抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。標的としたマーカー抗原は、MFG-E8、CD9、CD63、CD81、Flotillin等を選択した。これらの抗体の多くは、ELISAやフローサイトメトリーで利用可能でも、ウェスタンブロッティングでは適用できなかったが、抗MFG-E8抗体、抗CD63抗体の一部は利用可能であることを明らかにした。このことにより、次に展開するBLV感染牛からの乳エキソソームの磁気精製・濃縮とBLV抗原の検出における、エキソソームコントロール評価系を確立することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
白血球中のBLVコピー数が明らかな2頭の感染牛から、BLV感染陽性コントロール乳を採材していたが更新（出荷）されてしまったため、継続的に実験に使えるBLV感染乳牛および協力農家を新たに見いだす必要があった。その時間が予想以上にかかってしまった。しかし、超遠心を何回も繰り返し、長時間かけて乳エキソソームを分離・精製する方法を、効率よく時間短縮することが可能となり、計画の遅れを取り戻せることから、最終的には目的を達成できる見込みである。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの成果をもとに、乳エキソソームに特異的な表面抗原を標的とした、磁気ビーズ標識抗体を用いた磁気分離・精製法を確立する。ウェスタンブロッティングで乳エキソソーム検出に優れていたMFG-E8、CD63、およびウェスタンブロッティングでは利用出来なかったが、以前我々が磁気精製に利用したCD9に対する抗体と、磁気ビーズ標識二次抗体との抗体複合体を作成する。脂肪球、カゼインを取り除いた生乳、および未処理の生乳と抗体複合体とを混合し、乳エキソソームの磁気分離・精製を行う。精製後のエキソソーム量を、確立したウェスタンブロッティングによる評価系により比較し、エキソソームの磁気分離・精製に有用な表面抗原と抗体の同定、効率的な精製法を確立する。
確立した分離・精製法により、白血球中のBLVコピー数が明らかな感染牛の生乳からエキソソームを分離・精製し、乳エキソソーム内のBLV抗原をウェスタンブロッティングにより検出し、BLVコピー数と検出率の相関を明らかにする。感染牛のいる農場でバルク乳から分離・精製したエキソソーム内のBLV抗原および遺伝子を、ウェスタンブロッティング、PCR、LAMP法により検出、個体ごとに採取した乳エキソソームによるBLV抗原および遺伝子の検出結果と比較し、バルク乳検査による一括診断の実用性を評価する。
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| Causes of Carryover |
実験に使用する予定だったBLV感染牛2頭が、更新（出荷）されてしまい、感染牛と協力農家を新たに探すことになり、研究期間のはじめは実験できなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
2年目は、初年度に計画していた実験を精力的に実施することから、消耗品への支出を多く予定している。さらに、研究成果を学会発表、論文発表することを予定しており、旅費、英文校正料、オンラインジャーナル投稿料の支出を多く予定している。
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[Journal Article] Identification and characterization of a multispecific monoclonal antibody G2 against chicken prion protein2014
Author(s)
Kamatari, Y. O., Ohta, S., Inoshima, Y., Oda, M., Maruno, T., Kobayashi, Y., Ishiguro, N.
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Journal Title
Protein Science
Volume: 23
Pages: 1050-1059
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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