CRISPR/Cas9システムを利用したほ乳動物の産み分けに関する研究

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26660256
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 南 直治郎 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (30212236)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金子 武人 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30332878)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 産み分け / 受精阻害 / Crispr/Cas9 / ノックイン

Outline of Annual Research Achievements

本研究では受精を阻害できる遺伝子Xを、近年開発されたゲノム編集技術であるCrispr/Cas9システムを用いて性染色体にノックインし、遺伝子Xをもつ精子の受精を阻害することで雌雄の産み分けを可能にする技術の開発を目的とした。
導入遺伝子はプロタミン１プロモーター制御下において、遺伝子X およびAcGFPを発現するように構築し、制限酵素処理によって直鎖状にして顕微注入に用いる。また、性染色体上における遺伝子Xの挿入部位は、ヘテロクロマチン領域および機能遺伝子領域を避けた部位でかつ、Crispr/Cas9システムによって認識される、オフターゲットの少ないものの中から選出した。これらの条件を満たす領域の選出にはNCBIのゲノムデータベースおよびgRNA設計サイト（http://crispr.mit.edu/）を参照し、X染色体上ではCAGATTGAAGTCAACCATCG、Y染色体上ではACTAGGTCGTTTCTACAATTの配列を持つ部位に決定した。同定したターゲットシーケンスをpx330プラスミドにライゲーションし、目的部位をPCRによって増幅させ、その産物をMEGAshortscriptT7 kitでin vitro転写を行うことによってCas9が認識するgRNAを作製する。hCas9についても同様にin vitro転写を行うようにプラスミド に組み込んだ。さらに、Crispr/Cas9により切断された性染色体の上流50bpと直鎖状にした導入遺伝子の上流50bp、直鎖状にした導入遺伝子の下流50bpとCrispr/Cas9により切断された性染色体の下流50bpをそれぞれ接続した計100bpのオリゴDNAを2本作製した。
以上のように作製した導入遺伝子、gRNA、hCas9、オリゴDNAを同時にマウス受精卵に顕微注入することで、効率的に遺伝子Xを性染色体にノックインできる。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

目的の遺伝子の導入部位もX、Y両性染色体について確定できた。また、ノックイン方法についても昨年度に学会発表されオリゴDNAを用いる方法を用いることにより、より効率よくノックインができることが明らかとなったため、本研究においてもこの方法を用いて、ノックインを行うための遺伝子の精製等を行っている。

Strategy for Future Research Activity

本年度は昨年度に構築した遺伝子をマウス受精卵に顕微注入して、胚盤胞期における導入効率について検討する。また、遺伝子構築においては導入遺伝子にCMV制御下でm-Cherryを発現する導入遺伝子を作製し、受精卵に導入後m-Cherryを発現した胚、つまりノックインがうまく行われた胚のみを発情を同期化した偽妊娠雌マウスに移植できるように遺伝子を設計する。この方法によって生まれた雄マウスを用いて、後代の産子の性を確認する。

Causes of Carryover

6万円ほどの繰越が生じたが、これは遺伝子構築にかかる経費が予定より少なくなったためである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

この経費は今年度の遺伝子構築あるいは受精卵移植のためのマウスの購入に充てる予定である。