CRISPR/Cas9ゲノム編集による筋ジストロフィー疾患モデルミニブタの開発

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26660258
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 小野 悦郎 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00160903)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柴田 昌利 静岡県畜産技術研究所, その他部局等, その他 (70501443)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: ゲノム編集 / 筋ジストロフィー / 疾患モデル / マイクロミニブタ

Outline of Annual Research Achievements

CRISPR/Cas9システムを用いたマイクロミニピッグのゲノム編集方法を確立し、既存の動物モデルであるマウスやイヌでの問題点を克服したジストロフィン遺伝子を欠損させた次世代型デュシェンヌ型筋ジストロフィーマイクロミニピッグを開発することを目的として、以下の実験を実施した。
1) ゲノム編集用プラスミドのマイクロミニピッグ受精卵前核へのインジェクションによるゲノム編集操作を3回実施した。１回目は、14個、2回目は3個の胚を移植し受胎しなかった。3回目は、40個の胚を移植したが着床しなかった。
2) ゲノム編集用合成crRNA+tracrRNA+Cas9蛋白の受精卵前核へのインジェクションによるゲノム編集操作を実施し、20個の胚を移植したが着床しなかった。
3) ゲノム編集用合成sgRNAとCas9 mRNAの細胞質へのインジェクションによるゲノム編集操作を2回実施し、胚の移植をインジェクション当日に変更した。１回目は、104個の胚を移植し妊娠を確認しており、平成28年5月18日の出産予定である。2回目は、85個の胚を移植し着床を確認した。
以上の結果から、マイクロミニピッグのゲノム編集方法として、操作が簡単な合成sgRNAとCas9 mRNA或は合成sgRNAと核移行シグナル付きCas9蛋白の受精卵細胞質へのインジェクションを行い、当日に仮親ブタへ40個以上の胚を移植する方法が有望であることが示された。また、将来の疾患モデルマイクロミニピッグを用いた幹細胞移植再生医療モデルシステムの構築のために、骨髄由来間葉系幹細胞の分離・培養方法を確立した。