Studies on the freeze-drying of mammalian preimplantataion embryos

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26660261
• Research Institution: Kindai University
• Principal Investigator: 加藤 容子 近畿大学, 農学部, 教授 (40278742)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 凍結乾燥 / 凍結保存 / 初期胚 / 保存 / 胚盤胞

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、哺乳動物胚盤胞の凍結乾燥保存を試みた。現在、卵子や哺乳動物初期胚の保存は液体窒素を用いた凍結保存が一般的である。しかしながら、凍結保存は手法が難しいことや管理が煩雑で、もし震災等により保管タンクが損傷したり、液体窒素の供給が途切れたりすると保存が継続出来なくなる危険性もある。一方、凍結乾燥は長期保存が容易であり、将来的に有望な細胞保存法と考えられる。細胞の凍結乾燥保存では、1998 年にマウス精子の凍結乾燥が成功してから、相次いで体細胞の凍結乾燥が試みられた。しかしながら、 サイズが大きい哺乳動物初期胚の凍結乾燥保存についてはほとんど検討されていない。そこで、本研究では、初期発生過程中でもっとも細胞サイズが体細胞に近く小さい胚盤胞に焦点を当てて凍結乾燥を試みた。
まず、マウス胚盤胞を用いて諸条件を検討した。m-ETBS培地で10分処理後に凍結乾燥し、その後、37℃で培養すると、24時間以降で胞胚腔は徐々に小さくなり、細胞数も減少することがわかった。次に、トレハロースを添加したところ、胞胚腔が回復する割合が高くなり、透明帯や栄養外胚葉の破損率も有意に少なくなった。さらに、rehydration時に培地を用いると生存率が向上することが分かった。ブタでは単為発生由来胚盤胞を用いてトレハロースあるいはハチミツを添加した区を設けて検討したが、全ての区において凍結乾燥後に胞胚腔が回復する胚は見られなかった。
以上の結果より、マウス胚盤胞では、m-ETBSにトレハロースを添加したm-ETBSで凍結乾燥した後、Rehydration時に培地を加えると培養後に胞胚腔が回復することがわかり、哺乳動物胚盤胞が凍結乾燥できる可能性が示唆された。