2015 Fiscal Year Annual Research Report
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26660271
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
LEE JAEMAN 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (50404083)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | DNA導入法 / BmN4-SID1 / 遺伝子導入効率 / 長鎖DNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、カイコBmN4-SID1細胞をベースに効率的なDNA導入法の確立を目指して研究を進めた。主として２つのアプローチを用いたが、まず、dsRNAとdsDNAを結合できる親和性の融合タンパク質を作製し、dsRNAとdsDNAをこのタンパク質を介して結合させることにより、dsDNA取込み能の向上を試みた。RNAを結合するタンパク質としては、ラムダNタンパク質、dsDNA結合タンパク質としては古細菌由来のsso7dを用い、BoxB配列を有するdsRNAとルシフェラーゼ発現ベクターを作製した融合タンパク質を用いて結合し、BmN4-SID1細胞への導入を行った。0.05 mM以上の融合タンパク質を加えた場合に効果が認められたが、低濃度では効果が低かった。また、sso7d 単独やプロタミンなどDNAを部分的に凝集させる効果を持つタンパク質についても遺伝子導入効率に与える影響を検討したが、効果は認められなかった。ついで、膜タンパク質であるSID1のN末端部分にDNA結合能を持つ短いペプチド、sso7d及びヒトLAMP2C領域を付加することによる影響を解析した。これらの融合配列を有する組換えタンパク質を発現する形質転換細胞を樹立し、ルシフェラーゼ発現プラスミドの導入を試みたところ、sso7d―SID1及び逆向きLAMP2C―SID1発現細胞においてDNAの取り込み能が上昇していた。また、これらのペプチドの付加によるdsDNA取込み能の顕著な低下は認められなかった。また、これらの細胞を用いて、長鎖DNAの取り込みについても検討した。バキュロウイルスゲノムを有する120 kbpのBacmidの導入を試みたところ、通常の方法では導入効率はかなり低かったが、細胞を培地ごとゆっくり振盪することにより、導入効率が上昇し、ウイルス粒子の産生が起こることを見出した。
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