Application of the gene knockout method using CRISPR / Cas system to the hemipteran insect

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26660274
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 松本 由記子 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門 昆虫制御研究領域, 主任研究員 (80414944)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: CRISPR / ツマグロヨコバイ / parental RNAi

Outline of Annual Research Achievements

parental RNAiと同じ手法を用いる計画であるため、NcLac2遺伝子（ツマグロヨコバイ表皮で高発現し、表皮の硬化や色素沈着に関与すると考えられるラッカーゼ遺伝子）についてparental RNAiが有効であり、その次世代である孵化幼虫では色素沈着がほとんど起きず、かつ死亡率が高く、表現型が容易に判別できることを前年度に確認した。
NcLac2遺伝子をCRISPRの実験に用いた。NcLac2ゲノムDNA配列を確認したが、最も上流側の配列を確認できず（理由不明）時間を要した。ある程度確認できたゲノムDNA配列からNcLac2遺伝子5’側のエキソン-イントロン部位にsgRNAを2種類設計してCRISPRの実験を行った。理由は不明だが、これまで使用していたキット（mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra KitとMAXIscript kit）で作成したキャップ・polyA付加RNAおよびsgRNAともに非常に増幅・収量が悪く、何度か試行のあとに別のキット (T7 RiboMAX Express RNAi System)を利用してRNAを作成したため時間を要した。前回のCRISPR実験より高濃度にしたRNA・sgRNAでインジェクションを行い産卵させ孵化幼虫を回収してゲノムDNAを抽出してチェックしたが、ゲノムでの欠失は見られなかった。卵にRNAを打ち込む実験も試みたが、うまくいかなかった。