2014 Fiscal Year Research-status Report
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26660287
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
内田 隆史 東北大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (80312239)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
内田 千代子 福島大学, 人間発達文化学類, 教授 (80312776)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Pin1 / 細胞膜透過 / 細胞周期 / 細胞死 / 間葉系幹細胞 / 分化 / 脂肪細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
PTD-Pin1が細胞内に導入されたことを確認する目的で蛍光ラベルしたPTD-GFP-Pin1を作成し使用したが、細胞膜に結合しているだけなではないかという疑問は解消できなかった。この問題はPTD-Pin1を使用した研究の根本的な問題でありこれまでに多くの研究者を悩ませてきた。
この問題を解決するには、タンパク質が細胞に導入されると細胞の性質が変化するような系が必要である。我々は、今回、Pin1が細胞内に導入されると細胞周期が変化する細胞株を作成することに成功した。
Pin1-KOマウス胎仔線維芽細胞にパピローマウイルスのE6を導入し不死化したTakと、TakにレンチウイルスベクターにPin1ｃDNAを導入したresTakを作成し、これらの細胞を比較したところ、Takは細胞周期mitosis期に主に細胞が存在していたが、resTakは細胞周期G1に細胞が多く存在した。これらの結果から、PTD-Pin1がTak細胞内に侵入した場合には、細胞周期がM期からG1期に変化することが観察されることが示唆された。この観察はフローサイトメーターで簡単に行うことができた。この方法はまだPTD-Pin1の評価に応用していないが、今後この方法により、細胞内にPTD-Pin1が侵入しているか、単に細胞膜に結合しているだけなのかを正確に判定できるようになる。
また、Pin1が存在しないと間葉系幹細胞(Pin1-KO ASC)は皮膚、骨、軟骨への分化が劇的に低下することを見出した。我々は、間葉系幹細胞の株化にも成功しており、この細胞を用いてPTD-Pin1の細胞への導入を検出することも可能になった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
これまで多くの研究者がPTD結合タンパク質の作製を試み発表してきたが、本当に細胞内に導入され機能を発揮しているのかを明確に判定する手段はなかった。我々は今回PTD-Pin1の細胞内への導入について定量的な観察をするための方法（細胞株の作成と評価系）を確立することに成功した。PTD-Pin1に関しては大きな進展はまだないが、PTDタンパク質の評価系を作成したことは大きな進歩である。しかも、全く異なる二つの系、すなわちPin1-KO MEFとPin1-KO ASCを作成したことでより正確に細胞導入を評価できることを可能にした。
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| Strategy for Future Research Activity |
我々が作成した細胞株について詳細な検討を行い発表する。またPin1の導入量が判定量的に測定できるのか、または一定以上または以下という閾値のようなもので細胞が変化するのかを明確にする。
これまでに作成したPTD-Pin1を確立した細胞で評価する。また、PTD-Pin1の改良も試みる。さらにPin1だけでなく、Pin1のホモログであるPar14が機能的にもPin1の欠損を補償するかどうかも検証し、可能であれば応用する。
さらに、PTDを用いる方法が主であるが、これまでに行ってきたPin1の発現を変化させる薬剤や天然物の探索も今回作成に成功した細胞株で行う。
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| Causes of Carryover |
PTD-Pin1タンパク質は理論的に作成することができず試行錯誤で大量に作成する必要あること、また酵素の基質となるリン酸化ペプチドの合成も必要となること、さらに大量の細胞培養やフローサイトメーターでの解析などの試薬やメンテナンス費用、その他、情報収集のための交通費が必要となるので、それらに助成金を使用する予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
多様なPTD-Pin1の大量調製、リン酸化ペプチドの合成、細胞培養用血清、細胞周期測定用抗体、化学試薬、塩基配列決定依頼分析、学会、共同研究者との会議出張など。
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[Journal Article] Pin1 Promotes Neuronal Death in Stroke by Stabilizing Notch Intracellular Domain2015
Author(s)
1.Baik SH, Fane M, Hyung PJ, Cheng YL, Yun UJ, Choi Y, Park JS, Chai B, Park JS, Back aik SH, Fane M, Hyung PJ, Cheng YL, Yun UJ, Choi Y, Park JS, Chai B, Park JS, Back SH, Jeong JI, Jang YJ, Bahn G, Lee JY, Li YI, Sobey C, Uchida T, Park JH, Kim HT, Tang S, Arumugam T and Jo DG.
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Journal Title
Ann Neurol
Volume: 77(3)
Pages: 504-516
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Neurotensin Enhances Sperm Capacitation and Acrosome Reaction in Mice2014
Author(s)
3.Hiradate Y, Inoue H, Kobayashi N, Shirakata Y, Suzuki Y, Gotoh A, Roh SG, Uchida T, Katoh K, Yoshida M, Sato E, Tanemura K
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Journal Title
Biol Reprod
Volume: 91(2) 53
Pages: １-９
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] A High-Throughput Screen for Inhibitors of the Prolyl Isomerase, Pin1, Identifies a Seaweed Polyphenol that Reduces Adipose Cell Differentiation.2014
Author(s)
6.Mori T, Hidaka M , Ikuji H, Yoshizawa I, ToyoharaH, Okuda T, Uchida C, Asano T, Yotsu-Yamashita M, and Uchida T*.
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Journal Title
Biosci Biotechnol Biochem
Volume: 78
Pages: 832-838
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Site-specific Phosphorylation of Tau Protein is Associated with Deacetylation of Microtubules in Mouse Spermatogenic Cells During Meiosis.2014
Author(s)
7.Inoue H, Hiradate Y, Shirakata Y, Kanai K, Kosaka K, Gotoh A, Fukuda Y, Nakai Y, Uchida T, Sato E and Tanemura K
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Journal Title
FEBS Lett.
Volume: 588,
Pages: 2003-2008
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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