2014 Fiscal Year Research-status Report
Fluorobodyを用いた植物細胞死の網羅的解析
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26670046
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
森元 聡 九州大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (60191045)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 宏幸 九州大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (30253470)
坂元 政一 九州大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (50610177)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 細胞死 / モノクローナル抗体 / scFV / fluorobody |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度は、細胞死に関与する因子cyclophilin D (CycD)、 voltage-dependent anion channel（VDAC）、cytochrome c(Cytc）の大腸菌での大量発現を行い、いずれも十分な量の組み換えタンパク質の調製に成功した。
次いで、これらの因子のモノクローナル抗体を得るために、精製した組換えタンパク質をマウスに免疫した。抗体価の上昇を確認した後、マウスから脾臓を摘出し、ハイブリドーマを作成した。さらに抗体を産生しているハイブリドーマを限界希釈することにより、クローン株を樹立した。
今回樹立した株から産生する抗体はいずれもCycD、VDAC、Cytcに対して極めて特異性の高い抗体を産生していることを確認した。次いで、各抗体に対するscFVの作成を行った。すなわち抗体産生細胞からmRNAを抽出し、cDNAを調製した後。scFV遺伝子を作成するために、VH鎖VL鎖をコードする領域のクローニングを行った。さらに両鎖をスペーサーで連結したscFVとして発現するように遺伝子を構築し、それらを大腸菌で発現したが、いずれのscFVも不溶性タンパク質として発現した。そこで、不溶性タンパク質の巻き戻しを行ったところ、抗体活性を有するscFVの調製に成功した。
さらに上記で調製した各因子のなかでCycDのscFV遺伝子についてはカイコでの発現を試みた。この結果、カイコ中を用いた系ではCycDは活性体として発現しており、巻き戻しを必要としないことが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請書記の研究計画では、①細胞死誘導因子をコードする遺伝子のクローニング及び発現系の構築、②免疫原の調製及びマウスへの免疫、③モノクローナル抗体の作成、④小型化抗体scFVのクローニングを予定していたが、これらのすべての項目を達成していることから、申請課題は計画通りに進行していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、平成２６年度で作成したscFV遺伝子を用いて、fluorobody遺伝子の調製と大腸菌での発現を行う。もし、大腸菌で活性体として発現しない場合には、カイコでの発現系を用いる計画である。
発現したfluorobodyに抗体活性を蛍光活性が確認できれば、植物にfluorobody遺伝子を導入する。fluorobodyに抗体活性や蛍光活性が確認できなければ、再度scFVの設計を試みる。
Fluorobody遺伝子を導入した植物から培養細胞を調製し、それらにアポトーシス誘導刺激やネクローシス誘導刺激を加え、誘導される細胞死の特徴を詳細に解析することにより、細胞死におけるCycD、VDAC、Cytcの役割を解明する。
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