2014 Fiscal Year Research-status Report
微生物の生物機能を用いた次世代ケミカルプロセスの構築
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26670048
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Research Institution | University of Shizuoka |
Principal Investigator |
野口 博司 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (60126141)
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Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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Keywords | シンセティックバイオロジー / ケミカルバイオロジー / 大腸菌 / 生合成 / 天然物化学 |
Outline of Annual Research Achievements |
炭疽病の原因菌であるBacillus anthracisの生産する特殊なシデロホア、petrobactinの生合成メカニズムに関する研究において、グルコースの一次代謝物である3-デヒドロキナ酸(DHS)を芳香族化合物である3,4-ジヒドロキシ安息香酸(3,4-DHB)にワンステップで変換する酵素、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ(AsbF)を見出した(Hotta, K., et al., Biochemistry 2008)。本研究では、大腸菌BL21(DE3)を宿主としたT7システムによってAsbFを細胞内発現させ、DHSを3,4-DHBへin situ変換することを試みた。3,4-DHBは290nmの波長に特有の吸収を示すため、分光光度計を用い容易に検出および定量することができた。BL21(DE3)の培養条件は既報の条件下で行う(Hotta, K., et al., Biochemistry 2008)。現在このシステムを用い、LB培地から3,4-DHBを生産することが可能となった。 次に、3,4-DHBをカテコール(CAQ)に変換するKlebsiella pneumoniae由来の3,4-DHB脱炭酸酵素遺伝子、aroY (Draths, K., et al., J. Am. Chem. Soc. 1995) を上記システムに導入することで、同様の培養条件下で大腸菌宿主系によってCAQの生合成を試みた。asbFおよびaroYのBL21(DE3)での同時発現システムは、申請者が開発した、1つのpETベクター上に複数の遺伝子の発現を単一のT7プロモーターによって制御するオペロンを用い容易に構築できると考えられる(Watanabe, K., et al., Nature Chemical Biology 2006)。また、aroYなどの遺伝子を既知の塩基配列情報に基づき、遺伝子人工合成法によって取得すた。その時、コドンの最適化および有用な制限酵素認識配列の導入も合わせて行った。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画に沿った実験を行い、これまでのところ計画に沿った実験成果を挙げることができているため。
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Strategy for Future Research Activity |
今後、CAQの精製が必要となるがこれは、培養液からはXAD樹脂などを利用した固層抽出法を用いて分離精製する予定である。また、細胞内の合成産物に関してはアセトンを用い抽出し、LC-MSおよびNMRを用いて同定する。このシステムを用いたBL21(DE3)によるCAQ合成も合わせて確認する。次に、大腸菌異種発現システムを用いPseudomonas putida由来のカテコール-1,2-ジオキシゲナーゼ遺伝子、catA (Ridder, L., et al., Eur. J. Biochem. 1998) も同時発現させ、cis,cis-ムコン酸(ccMA)の生合成を試みる。
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