2014 Fiscal Year Annual Research Report
ヒストン修飾酵素の機能に関する網羅的スクリーニング
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26670085
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
中山 啓子 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60294972)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
舟山 亮 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20452295)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | CRISPR/Cas9 / メチル化酵素 / ES細胞 / 3T3-L1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、以下の二つのステップを行った。(1) ゲノム修飾を誘導するためのguide RNAの導入、(2) 超並列シークエンス解析によって集団を構成する細胞の決定、である。
ゲノム修飾を誘導するためのguide RNAの導入。まず導入ベクターの開発を行った。「PrecisionX Cas9 SmartNuclease System (SBI)」を用いて、EEDなどのヒストン修飾酵素の遺伝子破壊をES細胞および3T3-L1細胞で行う。複数の遺伝子を対象とし、各タンパク質についてさまざまな点変異の導入を試みた。EED遺伝子に加えてPRC2複合体を構成するEZH2遺伝子などを対象とした。ついで、細胞への導入条件による導入効率の検討を行った。ベクターをES細胞や3T3-L1細胞に導入し、導入効率を判定した。3T3-L1細胞での複数個の遺伝子の同時に変異の導入を試みにおいては、150クローンの細胞のゲノムDNAから標的領域をキャプチャー・増幅して、クローン番号を識別が可能な塩基配列のアダプターを付加した後に次世代シークエンサーで塩基配列の決定を行った。150クローンをシークエンスの結果を根拠に5種類のグループに分類した。同様の実験をES細胞でも行い、シークエンスの結果を得ることができた。
ES細胞および3T3-L1細胞の分化誘導条件を検討した。条件検討は、分化マーカーの発現量の変化と、未分化マーカーの発現量の低下を根拠とした。また、同一実験を3回行い、再現性の確認を行った。
ES細胞で、クローニングされた細胞が未分化性を維持していることの検証を行ったが、半数のクローンで分化マーカーの発現が確認され、実験操作によって未分化性の維持が破綻したのか、遺伝子破壊による影響であるのかの検証を行うことはできなかった。
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Research Products
(10 results)
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[Journal Article] CRL4(VprBP) E3 Ligase Promotes Monoubiquitylation and Chromatin Binding of TET Dioxygenases.2015
Author(s)
Nakagawa, T., Lv, L., Nakagawa, M., Yu, Y., Yu, C., D'Alessio, A. C., Nakayama, K., Fan, H. Y., Chen, X. & Xiong, Y
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Journal Title
Mol Cell
Volume: 57
Pages: 247-260
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Identification of acquired mutations by whole-genome sequencing in GATA-2 deficiency evolving into myelodysplasia and acute leukemia2014
Author(s)
Fujiwara, T., Fukuhara, N., Funayama, R., Nariai, N., Kamata, M., Nagashima, T., Kojima, K., Onishi, Y., Sasahara, Y., Ishizawa, K., Nagasaki, M., Nakayama, K. & Harigae, H.
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Journal Title
Ann Hematol
Volume: 93
Pages: 1515-1522
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] HCV infection enhances Th17 commitment, which could affect the pathogenesis of autoimmune diseases.2014
Author(s)
Kondo, Y., Ninomiya, M., Kimura, O., Machida, K., Funayama, R., Nagashima, T., Kobayashi, K., Kakazu, E., Kato, T., Nakayama, K., Lai, M. M. & Shimosegawa, T.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 9
Pages: e98521
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] GNE myopathy associated with congenital thrombocytopenia: a report of two siblings2014
Author(s)
Izumi, R., Niihori, T., Suzuki, N., Sasahara, Y., Rikiishi, T., Nishiyama, A., Nishiyama, S., Endo, K., Kato, M., Warita, H., Konno, H., Takahashi, T., Tateyama, M., Nagashima, T., Funayama, R., Nakayama, K., Kure, S., Matsubara, Y., Aoki, Y. & Aoki, M.
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Journal Title
Neuromuscul Disord
Volume: 24
Pages: 1068-1072
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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