2015 Fiscal Year Research-status Report
蛍光偏光観測による核ラミナのフィラメント構造と重合機構の解析
| Project/Area Number |
26670087
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
|---|
Principal Investigator |
佐藤 啓介 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (60644044)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
寺田 純雄 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (00262022)
川岸 将彦 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (60323606)
齊藤 健太 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (60374659)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | 細胞骨格 / 中間径フィラメント |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
１．LaminB1 平成26年度は、蛍光異方性を持つLaminB1-EGFPの安定発現細胞株をランダムインテグレーションにより樹立したところ発現量が大過剰になってしまったのが課題であった。平成27年度は、CRISPR/Cas9法を用いることにより、内在性LaminB1と同程度の発現量で発現する株を樹立することができた。
２．LaminA 平成26年度中に作製することができなかったLaminA-EGFPのconstrained taggingに引き続き取り組み、蛍光異方性を持つコンストラクトを得ることができた。上記LaminB1-EGFPの場合と同じようにCRISPR/Cas9法により細胞株を樹立した。蛍光異方性の強さについては改善の余地があったため、さらにconstrained taggingのスクリーニングを行った結果、新たに4種の蛍光異方性を持つコンストラクトを得ることができた。これらについても、CRISPR/Cas9法により細胞株の樹立を試みている。
３．全反射蛍光顕微鏡による蛍光異方性解析 協力研究者である谷博士の所属する、米国ウッズホール海洋研究所で全反射蛍光顕微鏡システムによる蛍光異方性解析を行った。このとき使用したのはHEK293細胞から樹立した細胞株であったが、当地の観察システムとの相性が悪く、残念ながら満足な観察をすることができなかった。そこで、新たにHeLa細胞で安定発現株の樹立を行っている。LaminAに関しては1種類のコンストラクトについて樹立済みである。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度の達成目標としていた、LaminAとLaminB1両方のconstrained taggingに成功し、計画通り蛍光異方性解析も行った。結果的には細胞株の変更をしなければならなくなったが、LaminAに関しては既に新たに安定発現細胞株を樹立済みのコンストラクトもあり、LaminAの他のコンストラクトやLaminB1についても間もなく樹立予定である。
以上から、全体としておおむね順調であると言って良いと思われる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
安定発現株を平成28年度の早期に完了する。それを用いて、米国ウッズホール海洋研究所にて全反射蛍光顕微鏡システムによる蛍光異方性解析を行う。この時点で、学会発表、論文発表を行う。
年度の後半では、HeLa細胞以外に解析対象を拡大し、核構造変化と核ラミナ構造の関連、細胞分化と核ラミナ構造変化との関連などに関して解析を行う。
|
| Causes of Carryover |
平成27年度中に小型CO2インキュベーターを購入する必要が無くなったこと、および平成28年度に当初の計画より多く海外共同研究を行うと予想されるので、その資金を確保するため。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
小型CO2インキュベーターを平成28年度に購入する。谷協力研究者との海外共同研究を複数回行うための旅費に充てる。
|
