神経系可視化ゼブラフィッシュのゲノム編集によるＢＡＦ複合体の個体レベルの機能解析

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26670093
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 吉川 知志 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90244681)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: クロマチン再構成複合体 / ゲノム編集 / 神経細胞分化

Outline of Annual Research Achievements

[1]ゲノム編集によるBAF複合体変異系統の作成
実験系の有効性の検証を兼ねて、BAF複合体構成サブユニットの中からBAF45b（dpf1）をピックアップし、３カ所のガイドRNA標的配列をデザインして、それぞれをCAG-hspCas9-H1ベクターへ組み込んだ。また、CAG-hspCas9-H1ベクターのH1プロモーターをゼブラフィッシュU6プロモーターに置換したベクターを作製し、その直下に先の３つ標的配列をそれぞれ組み込んだものも作製した。各プラスミドをゼブラフィッシュ受精卵に注入し、数日後にゲノムDNAを抽出しゲノム編集結果を評価した。この方法は注入用RNAの合成等の必要がなく非常に簡便であるため、多数の遺伝子を編集する際に有効と思われたが、ゲノム編集の効率は期待したよりも低かった。そこで、常法通りにCas9 RNAとガイドRNAを鋳型プラスミドよりin vitro転写により合成し注入した。RNA注入の数日後にゲノム編集を評価したところ、非常に高い効率（注入胚の90％超）で標的ゲノム領域に何らかの編集が生じていることが確認された。以後は本法を用いる事とし、各遺伝子を標的とする注入を順次、行っている。それぞれ２種類のガイドRNAを作製し、いずれの編集効果も期待通りでない場合には新たに標的配列を追加し再トライする。現在、３遺伝子についてゲノム編集箇所のシークエンシングなどの予備的解析を行いつつ、F0世代を飼育中である。
[2]遺伝子ノックダウンによるBAF複合体の機能解析
上記[1]と並行して、BAF45b（dpf1）に対するモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを受精卵に注入して一過性の発現阻害を行い、神経系の発生に対する影響の検討を試みた。dpf1遺伝子座にGFP遺伝子の挿入を有するdpf1-tTA-GFPフィッシュを中心に、中枢神経系に蛍光蛋白質を発現する複数のトランスジェニック系統を用いて実験を行ったが、現在までのところ、著明な中枢神経発生異常は残念ながら確認できていない。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ゼブラフィッシュ受精卵に対するゲノム編集実験については、当初計画したプラスミドの注入による方法は期待通りの編集効率を得ることはできなかったものの、より一般的な方法である合成RNAを注入する方法に変更する事で、これまでのところ期待通りの編集結果を得ている。標的遺伝子を順次、増やして変異体の確立を進めていく。注入後の卵の生育もおおむね順調であり、成長した個体が得られ次第、順次交配し、F1世代を用いた生殖系列細胞におけるゲノム編集の解析に進む予定である。
遺伝子ノックダウンによるBAF45bの機能解析については、現在のところ神経系の発生に対する影響を観察するには至っていないが、今後は他のサブユニット遺伝子に対象を広げ、検討を続けていくことで成果を期待する。

Strategy for Future Research Activity

基本的には交付申請書どおりに研究課題を進める。すなわち、[1]ゲノム編集によるBAF複合体変異系統の作成と[2]遺伝子ノックダウンによるBAF複合体の機能解析を同時並行的に進める。特に、[1]ではBAF複合体構成各サブユニット（BAF45a、b、c、d 、BAF53a、b、BAF155、BAF170など）へ順次、ゲノム編集対象を広げていく。F1世代のゲノム編集標的領域の塩基配列解析により、null変異を有しモザイク率の高いF0個体を選別の上、F1、F2世代を増やし変異体系統を確立する。系統として確立された変異体から順次、蛍光蛋白質トレーサーを発現するトランスジェニック系統との交差交配を行った後、ホモ変異体を作製する事で遺伝子ノックアウトが神経系発生に及ぼす影響を解析する（平成27年度研究実施計画[3]）。

Causes of Carryover

ゲノム編集法をプラスミドを直接、注入する方法からRNAを合成して注入する方法に変更した事に伴い、比較的価格が高価なプラスミドキットの購入量が減ったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当該プラスミドキットの購入を見込んでいた額を、新たに必要となったRNA合成用キット等とモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの追加購入費用に振り替える。当初に見込んでいたより多数のモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドが購入可能になり、検討対象遺伝子を増やしたり、各遺伝子に対してより多数の配列を検討する事ができる。