神経系可視化ゼブラフィッシュのゲノム編集によるＢＡＦ複合体の個体レベルの機能解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26670093
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 吉川 知志 神戸大学, 医学研究科, 准教授 (90244681)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: クロマチン再構成複合体 / ゲノム編集 / ゼブラフィッシュ

Outline of Annual Research Achievements

常法に従い、Cas9 RNAと各標的遺伝子（BAF複合体構成因子）に対するガイドRNAを鋳型プラスミドよりin vitro転写により合成し、野生型ゼブラフィッシュ受精卵に注入した。ガイドRNA配列のデザイン検索サイトの情報をもとに標的遺伝子に対してそれぞれ複数のガイドRNAを作製し、いずれの編集効果も期待通りでない場合には新たに標的配列を複数追加し再トライした。RNA注入の数日後に各編集標的領域近傍のゲノムPCR断片のT7ヌクレアーゼアッセイによりゲノム編集の有無を評価したところ、非常に高い効率（注入胚の60％超）で標的ゲノム領域に何らかの塩基配列の編集が生じていることが確認された。現在、合計５遺伝子についてゲノム編集箇所のシークエンシングなどの解析を行いつつ、F2世代（ノンモザイク-ヘテロ変異体）を飼育中である。BAF45b遺伝子の変異体については、フレームシフトを生じ、null変異が期待できる編集結果を有するものが複数系統得られており、BAF45b遺伝子座近傍にGFP遺伝子の挿入を有するdpf1-tTA-GFPフィッシュおよび分化ニューロン全般に緑色蛍光タンパク質Kaedeを発現するHuC-Kaedeフィッシュをバックグラウンドに、相互交配によりトレーサー蛍光蛋白質を発現するゲノム編集系統を作出した。これらのトランスジェニックヘテロ変異体を相互交配することにより得られる、トレーサー発現ホモ変異体の中枢神経系発生解析を実施するべく予備実験中である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

連携研究者の早期退職という、当初想定できなかった事由が生じ、それに伴って本年度の研究実施体制について大幅な見直しを行う必要が生じたため。さらに上記事由により、研究代表者自身が確保できる研究エフォートも大きく影響を受け、十分な研究時間を確保できず、予定した変異体の解析を実施できなかったため。

Strategy for Future Research Activity

原則として交付申請書どおりに研究課題を進める。すなわち、ゲノム編集によるBAF複合体変異系統の作成と遺伝子ノックダウンによるBAF複合体の機能解析を同時並行的に進める。特に、蛍光トレーサーを発現する遺伝的バックグランドでのBAF45bのゲノム編集変異体の中枢神経系の発生を、トレーサー発現細胞の発生パターンを指標に詳細に解析する。また、他のBAF複合体構成各サブユニット（BAF45a、c、d 、BAF53a、b、BAF155、BAF170など）のゲノム編集系統へ順次、解析対象を広げていく。

Causes of Carryover

連携研究者の早期退職という、当初想定できなかった事由が生じ、それに伴って本年度の研究実施体制について大幅な見直しを行う必要が生じ、研究の進捗が全体として遅れ、予算の支出自体も少なかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当初の研究計画の未実施部分を次年度に新しい研究実施体制で行うことで、当初の研究計画に準じた予算を支出する計画である。