2015 Fiscal Year Research-status Report
摘出灌流心を用いたイオンチャネルの細胞膜発現量変化の定量的イメージング法
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26670118
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
石井 邦明 山形大学, 医学部, 教授 (10184459)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永澤 悦伸 東邦大学, 薬学部, 講師 (40513057)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | チャネル / GFP変異体 / イメージング / 心筋 / 受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
動物摘出灌流心において、KCNQ1(ゆっくりと活性化する遅延整流性Kチャネルの主サブユニット)の細胞膜発現量の変化をリアルタイムで可視化できるモデルを確立することを目的に検討を行った。
1. pHluorin融合KCNQ1安定発現細胞株の作製と検討
昨年度の結果から、検討対象であるpHl-KCNQ1（pHluorin《pH感受性を有するGFP変異体》を、KCNQ1の細胞外領域に融合させたコンストラクト）の細胞膜発現量が不十分である可能性が考えられたため、pHl-KCNQ1を恒常的に発現するHEK293細胞を作製した。KCNQ1の細胞膜発現量を変化させるために、その細胞にα受容体を発現させ（これまでの検討でα受容体刺激がKCNQ1のエンドサイトーシスを惹起することを確認している）、共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討を行ったが、一過性発現の場合と同様、僅かなpHl-KCNQ1の蛍光量変化しか得ることが出来なかった。また、コントロールとして、顕著なエンドサイトーシスが起こることが知られているβ2受容体とpHluorinの融合コンストラクトを用いた検討も行ったが、KCNQ1の場合と同様の結果であった。
2.pH感受性GFP変異体に関する検討
GFP変異体のpH感受性変化に関して、これまでに知られている情報（アミノ酸の変異部位とpH感受性変化の関係など）をもとに検討を行ったが、細胞レベルにおいても、本研究の目的を達成するのに必要なシグナル変化を得ることは出来なかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
高いpH感受性を有し、pH変化によって大きな蛍光量変化を示すGFP変異体の作製に成功することが、本研究の目的を達成するにあたっての最大のポイントである。研究計画作成段階から、可能性のある一番の障壁は、それに成功するかどうかという点であると考えていたが、現在そこを乗り越えられずにいる。最終目標に到達するまでの道のりは、まだ遠く、進捗状況としては遅れている現状である。
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| Strategy for Future Research Activity |
GFP変異体のpH感受性について、これまで報告されている情報をもとにした検討だけでは、目的を達成できない可能性がある。今後は、ランダムな変異体の作製を行うことも検討する。目的に叶うようなGFP変異体を手に入れることが出来れば、その先の研究計画の変更は必要ない思われる。
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| Causes of Carryover |
最大の理由は、動物を用いた検討まで進むことが出来なかったことである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度に計画されていた研究を進めるために使用したい。
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[Journal Article] ERK5 induces ankrd1 for catecholamine biosynthesis and homeostasis in adrenal medullary cells.2016
Author(s)
Obara Y, Nagasawa R, Nemoto W, Pellegrino MJ, Takahashi M, Habecker BA, Stork PJ, Ichiyanagi O, Ito H, Tomita Y, Ishii K, Nakahata N
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Journal Title
Cell Signal
Volume: 28
Pages: 177-189
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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