2016 Fiscal Year Annual Research Report
Imaging of quantitative changes in surface expression of ion channels using isolated perfused hearts
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26670118
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
石井 邦明 山形大学, 医学部, 教授 (10184459)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永澤 悦伸 東邦大学, 薬学部, 講師 (40513057)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | GFP変異体 / イメージング / チャネル / pH感受性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
動物の摘出灌流心において、KCNQ1(ゆっくりと活性化する遅延整流性Kチャネル（心筋活動電位の再分極に重要な役割を演じている）の主サブユニット)の細胞膜発現量の変化をリアルタイムで可視化できるモデルを確立することを目的に検討を行った。
1. pH感受性リガンドを用いた検討
pHluorin（酸性環境で蛍光強度が低下するGFP変異体）をKCNQ1の細胞外領域に融合させたコンストラクトを用いた検討で、期待する結果が得られなかったため、市販されているpH感受性Haloリガンド（酸性環境で蛍光が増大する）を用いた検討を行った。これまでに、HaloタグをKCNQ1の細胞外領域に融合させたコンストラクト（Halo-KCNQ1）が、α受容体刺激によってエンドサイトーシスすることは明らかになっている。Halo-KCNQ1をHEK293細胞に発現させ、細胞膜非透過性のpH感受性Haloリガンドを用いて、細胞膜上に発現しているKCNQ1のみをラベルした。その後、α受容体を刺激し、エンドサイトーシス（酸性環境であるエンドソームへの移動）による蛍光の増大が見られるかどうかを、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。残念ながら、エンドサイトーシスによる蛍光強度の増大を検出することは出来なかった。
2.pH感受性GFP変異体に関する検討
前年度までの結果を反省材料に、pHluorinをベースにしてアミノ酸変異をランダムに導入することによって、よりpH感受性が高いGFP変異体を得ることを計画した。スクリーニングの系として大腸菌を用いることを考え、大腸菌のペリプラズムに外来遺伝子を発現させるベクターにpHluorinをサブクローニングして、現在細胞外pHの変化がpHluorinの蛍光にどのような影響を与えるかを検討中である。
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[Journal Article] Licochalcones extracted from Glycyrrhiza inflata inhibit platelet aggregation accompanied by inhibition of COX-1 activity2017
Author(s)
Okuda-Tanino A, Sugawara D, Tashiro T, Iwashita M, Obara Y, Moriya T, Tsushima C, Saigusa D, Tomioka Y, Ishii K, Nakahata N
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Journal Title
Plos One
Volume: 12
Pages: e0173628
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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