2014 Fiscal Year Research-status Report
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26670128
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| Research Institution | Musashino University |
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Principal Investigator |
小濱 一弘 武蔵野大学, 薬学研究所, 客員教授 (30101116)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大室 弘美 武蔵野大学, 薬学研究所, 教授 (00124470)
懸川 友人 城西国際大学, 薬学部, 教授 (80169391)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胞骨格 / アクトミオシン系 / 微小管系 / ミオシン軽鎖キナーゼ / 発現阻害 / 細胞分裂 / 細胞核分裂 / 細胞周期 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血管平滑筋の病態生理ではその増殖は重要な課題である。血管平滑筋細胞にはミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)が制御因子として存在するが、MLCKの増殖における機能は十分には解明されていない。
申請者らは、種々の方法でMLCKの発現を阻害したところ、意外にも、増殖を観察することができた。即ち、MLCKは増殖の際には、阻害因子として作用していると考えられた。
一方、細胞増殖は細胞分裂と細胞核分裂に分けることができ、古くから前者はアクトミオシン系、後者は微小管系が働いているとされる。しかし、MLCKの欠損株を用いた実験により得られたデータは、これに一石を投げるもので、前者ではミオシンのリン酸化に、後者ではMLCKを介するアクトミオン系による制御を再度検討・チャレンジする余地を与えている。
本研究では、抗癌薬としては微小管系を介するものが古くから使用されているが、アクトミオン系を介する抗癌薬開発の可能性にも言及する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請者らは、かつて血管平滑筋（VSMC）の形質転換と、それに伴った細胞運動へのMLCKの効果に興味を持ち、MLCKの発現阻害の研究を行った。MLCK欠損株の細胞運動は阻害されたが、増殖については欠損株でも観察された。MLCKには２つのisoform (longとshort)が存在するが、最近、MLCKのsiRNAをレンチウイルスによりVSMCに導入して効率良く細胞内発現ができたため、RNAi阻害現象により、全てのisoformが発現しないVSMS株GbSM4(MLCK-)を得ることができた。意外なことにこのMLCK欠損株は、正常細胞よりも増殖し、また、増殖スピードが速かった。flow cytometry analysis （以下、「FACS」と略）を用いた細胞核内DNA測定によるcell cycle分析でも、S期の増強を伴ってproliferation indexが上昇した。本年度はまずは、これを確認した。
次にモルモット脳底動脈由来のGbaSM4(WT)細胞、及びこの細胞にレンチウイルス・ベターを用い、MLCKに対するRNAiを恒常的に発現しているSMbaSM4(MLCK-)細胞を培養する。GbaSM4(MLCK-)には両isoformも欠損していることを、ウエスタンブロット法により示した。
さらに、ブロモデオキンウリジン（BrdU）を培養液に加え、細胞に取り込ませる。軽く固定した後、抗BrdU抗体(Roche Diagnosis社)により染色する。蛍光顕微鏡下でデオキンチミジン（TdR）の代わりにBrdUを取り込んでいる核とそうでない核数をカウントして比率を見る。この手法で、GbaSM4(WT)とGbaSM4(MLCK-)を比較し、GbaSM4(MLCK-)の方に取り込み（％）が多いこと、即ちMLCKがDNA合成を阻害していることを確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
培養器の中で、time-elapse recordingを行い、1つの細胞から完全に2つの細胞に分裂するのに要する時間を測定する。この測定をGbaSM4(WT)とGbaSM4(MLCK-)で行い結果を比較する。定量的には、両者の細胞を96穴プレートでlow destiny caltureを行う。24時間ごとに培地をとりかえると同時に、“生きている細胞”を検出するMTT assayを行い、増殖している細胞を定量する。GbaSM4(MLCK-)の方が良好な増殖をすることを示す。さらに、細胞周期と関係付けるため、増殖させたGbaSM4(WT)及びGbaSM4(MLCK-)をFACSを用いてG1期、S期、G2/M期をproliferation indexを算出する。S期にある細胞数がMLCK欠損により増加することが予想されるが、BrdUの取り込みと関係付ける。以上、平成26年度の結果を確実なものとするとともに、ⅰ）細胞核内のMLCKによる培養血管平滑筋の増殖阻害を明らかにする。ⅱ）RNA干渉によるMLCK発現の欠損では、細胞周期のS期の細胞増加を明らかにする。ⅲ）MLCKはアクチン経由による効果で、キナーゼ活性ではないことを明らかにする。また、ⅳ）S期の両細胞における翻訳と転写の状態を比較する。これらをもとに、研究の目的にした項目を明らかにし、成果の発表を行う。
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| Causes of Carryover |
実験等に使用した試薬等の一部は既に手元にあったものを使用し、新たに購入しなかったこと、また、当年度に実施する予定の実験の一部が実験系の影響で当年度に実施できなかったことが理由である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度に試薬等を購入し、また、当年度実施予定で実施できなかった実験の一部を次年度に実施する。
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