2016 Fiscal Year Annual Research Report
Gene therapy using the in vivo gene targeting technology
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26670140
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
松田 孝彦 京都大学, 物質－細胞統合システム拠点, 研究員 (40313093)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / 網膜 / 内在性蛋白質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
動物細胞においてゲノム上の任意の部位に特異的に変異を導入する「ジーンターゲティング法」は、これまではマウスES細胞（相同組換えが1/10～1/1000の高頻度で観察される）などの限られた細胞株でのみ適用可能であった。これは、マウスES細胞などの一部の例外を除き、一般にゲノムの相同組換えは10万分の1程度の頻度でしか起こらないからである。しかし、ここ数年、Zinc finger nuclease, TALEN, CRISPR/Cas9といったゲノム上の任意の１カ所のみを特異的に切断する「人工ヌクレアーゼ」が開発され、状況は激変した。すなわち、人工ヌクレアーゼでゲノム上の目的のサイトを特異的に切断する事により、ゲノムの相同組換え効率が飛躍的に上昇する事が示され、その有用性が注目されている。そこで本研究では、(1)基礎データの収集を通じて『in vivo ジーンターゲティング法』の至適条件を確立し、(2)この技術を網膜変性疾患モデルマウスに応用し、遺伝性疾患の原因遺伝子の修復（遺伝子置換）技術の確立を目的とした。
初年度には、標的として選んだ全ての遺伝子座に対し、CRISPR/Cas9依存的に蛍光蛋白質遺伝子がノックイン出来ることを確認した。２年目にあたる平成27年度は、これら標的遺伝子座へノックイン効率を更に上げるための至適条件を検討した。その結果、ターゲティングベクターの5’と3’の相同領域の至適な長さや、Cas9を発現させる至適なタイミングを決定することが出来た。最終年度の平成28年度は、遺伝子ノックインに伴うCas9の強制発現による副作用を検証した。その結果、遺伝子を導入して約１年後でも明らかな細胞毒性は観察されず、本技術は疾患治療に応用できると考えられた。
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