2015 Fiscal Year Research-status Report
改良型レーザーカッターによるアミロイド物質の生体構造と機能解析
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26670152
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
樋口 京一 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (20173156)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
八谷 如美 東京医科大学, 医学部, 教授 (30408075)
澤下 仁子 信州大学, 学術研究院医学系, 助教 (40359732)
矢崎 正英 信州大学, 学術研究院医学系, 准教授 (70372513)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | アミロイドーシス / プロテオーム解析 / 老化 / 実験病理学 / レーザーマイクロダイセクター / 線維蛋白質 / バイオ関連機器 / 凝集体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アミロイド物質の構造と機能と伝播性の解析のために、画期的なレーザーマイクロダイセクター(ALMD)を使用して、マウスとヒトアミロイドーシスにおける、アミロイド沈着の時間的、部位的微小空間を切り取り、プロテオーム解析とマウスを用いた伝播性解析に焦点を当てた研究を行なうことを目的とする。解析対象は、①AApoAII アミロイドーシス、②実験的AA アミロイドーシス、③神経変性疾患や全身性アミロイドーシス患者組織、である。平成27年度は以下のような研究実績を得た。
1. マウスAApoAIIアミロイドーシスでのプロテオーム解析ではマウスにAApoAIIアミロイド線維10 μgを静注してアミロイド沈着を誘発し、継時的に屠殺して肝臓を採取し、凍結試料と組織切片を作成した。凍結組織からアミロイド線維分画を抽出するとともに、組織切片のアミロイド沈着部位の周囲を超微細レーザーで焼き切リ、アミロイド沈着部位のみを採取して網羅的プロテオーム解析をおこなった。アミロイド沈着に特異的なアミロイドーシス関連蛋白質としてApolipoprotein E (ApoE), Clusterin, Vitronectin, CD81を同定した。それぞれの蛋白質のアミロドーシスの進行に伴う量的変動等を解析した。
2. 家族性アミロイドポリニューロパチー患者肝臓のドミノ移植を受けた患者の胃及び十二指腸のバイオプシー実施し、移植後14ヶ月で非常に微細なアミロイド沈着を観察した。アミロイド沈着を認めた患者組織切片から、ALMDを用いてアミロイド線維蛋白質を抽出し、質量分析を行った。その結果、FAP患者に由来する変異型TTR蛋白質の沈着であることを明らかにし、移植後2年では正常(wild)型のTTRも沈着することを明らかにした（Yoshinaga T, et al J Path: Clin Res 2016.）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究分担者の八谷の開発した画期的なレーザーマイクロダイセクター(ALMD)は、改良が継続されている。ALMDは研究分担者の矢崎や研究代表者の樋口の研究グループをはじめとして、アミロドーシスの沈着蛋白質の同定に頻繁に利用されるようになり、利用頻度が顕著に増大しているため、新たな装置の製作が進行している。矢崎は平成27年度に、ALMDを用いて一般のレーザーダイセッションでは不可能であったごく微小な組織切片上のアミロイド沈着からアミロイド線維の抽出に成功した。FAP患者肝臓のドミノ移植を受けた後、世界で最も短期間（移植後14ヶ月）でFAP患者肝臓由来の変異型TTRでまず沈着し、さらにその線維にwild typeのTTRがわずかづつであるが沈着することを世界で初めて直接的に示すとこができたのは予想以上の成果であった（Yoshinaga T, et al J Path: Clin Res 2016.）。また、研究代表者は平成26年度にAApoAIIアミロイドが沈着したマウス肝臓の生化学的に分離したアミロイド線維分画と、とALMDで切り取ったアミロイド沈着領域の網羅的プロテオーム解析を行い、アミロイド沈着に特異的な関連蛋白質として同定したApoE, Clusterin, Vitronectin, CD81の詳細な量的変動や脂肪沈着との関連を解析した。その結果、ApoEはアミロイド線維分画中の量が急激に増大するが、血中濃度は急激に減少した。一方、血中のClusterin濃度は上昇することが明らかになった。これらは当初の計画以上の成果ということができ、その成果は学会等で発表した。一方で、パラフィン組織切片からのプロテオーム解析の感度向上に関しては、まだ改善されておらず、凍結組織を用いた解析も十分でない等、27年度に計画した研究の推進が十分に実施できなかったことが反省点である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度以降も27年度の研究の継続が必要である。特に研究分担者八谷は所属も変わり、ALMDの改良と利用促進を推進する。そのために昨年度発足させたダイレクトバイオロジー研究会の第2回の発表会を企画する。ホルマリン固定したサンプルや、既存の病理組織切片を用いたALMDとプロテオーム解析の感度の顕著な改善を目指して、研究グループ内外の協力を推進する。それに加えて28年度は27年度に進捗した研究をさらに発展させ、十分な成果が得られなかった以下の研究を実施を目指す。
1.順調に進捗した全身性アミロイドーシスのアミロイド蛋白質の同定をさらに発展させる。特にTTRのドミノ肝移植の患者でのアミロイド沈着の解析を継続し、wild type TTRの沈着やTTRの断片化について解析する。さらにTTRの構造安定化剤であるtafamidisの治療効果を明らかにする。また、AApoAIIアミロイドーシスの関連蛋白質の解析については論文発表を早急に行なう。
2.進捗が遅れている、マウスAApoAII やAAアミロイドーシスを発症したマウスの凍結切片を利用して、抗体染色後のALMDによる解析領域の切り出しとナノフローLC/MS/MSシステムを用いたプロテオーム解析の方法論の確立と推進を行う。また、切り出した空間のアミロイドーシス伝播力の解析を進める。具体的にはマウスにAApoAIIアミロイドーシスを発症させ、アミロイド沈着の中心から周辺に向かって切片を切り出し、SAMR1C-Apoa2c Tgに切り出した検体を投与し、２ヶ月後のアミロイド線維沈着を検出して伝播力を解析する。
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| Causes of Carryover |
平成27年度は26年度で同定したアミロイドーシス関連蛋白質のWesterblotを主に用いた、血液やアミロイド線維分画中の量的解析を集中して行った。そのために、消耗品等の物品費等は増加したが、ALMD装置が設置されている、分担研究者である八谷の研究室へ向かう旅費が予定よりもかなり減少した。また、マウスの飼育や組織切片作成などの補助として、学生のアルバイトの謝金の支出を計画していたが、研究に参加した大学院学生が有効かつ効率的に実験を実施したために、アルバイトの必要がなくなり、その費用が計画より大幅に減少した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額は、平成28年度請求額と合わせて、計画的に使用し、さらなる発展を期す。
特に昨年度の研究成果を国際雑誌へ掲載するための費用や、昨年度に遅れの見られた、マウスAApoAII やAAアミロイドーシスを発症したマウスの凍結切片を作成して、抗体染色後とチオフラビンT染色後に、ALMDによる解析領域の切り出しとナノフローLC/MS/MSシステムを用いたプロテオーム解析の方法論の確立と推進を行う。特に、切り出した空間をマウスに投与して、アミロイドーシス伝播力の解析を進める。具体的にはマウスにAApoAIIアミロイドーシスを発症させ、肝臓の凍結切片を作成して、アミロイド沈着の中心から周辺に向かって切片を切り出し、SAMR1C-Apoa2c トランスジェニックマウスに切り出した検体を投与し、２ヶ月後のアミロイド線維沈着を検出して伝播力を解析する。
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[Presentation] Transgenic mouse models of WT and D76N β2-microglobulin amyloidosis.2015
Author(s)
Miyahara H, Yang M, Igarashi Y, Zhang P, Li L, Sawashita J, Thian G, Mori M, Higuchi K.
Organizer
Mini-workshop on Amyloidosis, Japan-Italy-UK
Place of Presentation
University Collage London (London, UK)
Year and Date
2015-09-28 – 2015-09-30
Int'l Joint Research / Invited
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