2016 Fiscal Year Research-status Report
改良型レーザーカッターによるアミロイド物質の生体構造と機能解析
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26670152
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
樋口 京一 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (20173156)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
八谷 如美 地方独立行政法人東京都立産業技術研究センター, 開発本部開発第二部バイオ応用技術グループ, 主任研究員 (30408075)
澤下 仁子 信州大学, 学術研究院医学系, 助教 (40359732)
矢崎 正英 信州大学, 学術研究院医学系, 准教授 (70372513)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | アミロイドーシス / プロテオーム解析 / 老化 / 実験病理学 / レーザーマイクロダイセクター / 線維蛋白質 / バイオ関連機器 / 凝集体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アミロイド物質の構造と機能と伝播性の解析のために、画期的なレーザーマイクロダイセクター(ALMD)を使用して、マウスとヒトアミロイドーシスにおける、アミロイド沈着の時間的、部位的微小空間を切り取り、プロテオーム解析とマウスを用いた伝播性解析に焦点を当てた研究を行なう。
平成28年度は研究分担者である八谷の移動に伴い、メイン装置であるALMDも移設された。移動及び調節のためALMDが使用できなかったことと、研究代表者の管理業務の多忙のために、研究の進捗が遅れたが、以下のような研究実績を得た。
①マウスAApoAIIアミロイドーシスでの肝臓アミロイド線維分画のプロテオーム解析ではアミロイド沈着に特異的なアミロイド関連蛋白質としてApolipoprotein E (ApoE), Clusterin, Vitronectin, CD81を同定した。これらの蛋白質の比率はアミロドーシスの進行に関わらず一定であったが、血液中濃度は、ApoA-IIとApoEは減少し、Clusterinは増加した。またアミロイド沈着部位に脂肪の沈着が認められた。
② 家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP) 患者では肝移植療法は極めて有効な治療法であるが、移植後にアミロイド沈着による眼症状を発症することが大きな問題となっている。肝移植後10年経過後に片眼摘出されたFAP患者の眼内・眼外組織に沈着したアミロイド蛋白質をレーザーマイクロダイセッションを用いて部位選択的に抽出し、質量分析 を用いて、沈着したTTRの変異型と野生型の比率を解析した。眼内組織には変異型TTR(>80%)が沈着するのに対し、外眼組織（外眼筋）では野生型が優位（＞71％）であり、眼内と眼外組織では、異なった分子病態でアミロイド線維が構成されることが明らかになった。（Yoshinaga T, et al. Amyloid 2017）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成28年度は研究分担者である八谷の移動に伴い、メイン装置であるALMDも移設された。移動及び調節のためALMDが比較的長期間使用できなかったことと、研究代表者の大学での管理業務が極めて多忙のために、研究の進捗が遅れた。現在は八谷の移動先で新たにもう一台のALMDが稼働している。
研究代表者は平成27、28年度にAApoAIIアミロイドが沈着したマウス肝臓から生化学的に分離したアミロイド線維分画と、ALMDで切り取ったアミロイド沈着領域の網羅的プロテオーム解析を行い、アミロイド沈着に特異的な関連蛋白質として同定したApoE, Clusterin, Vitronectin, CD81の詳細な量的変動やアミロイド沈着との関連の解析を継続した。その結果、これらの蛋白質がアミロイド沈着部位に存在し、従来、他のアミロイドーシスで報告されていたSAPやApoA-Iはアミロイド線維分画には存在しないことが明らかになった。その成果は現在投稿中である、一方で、パラフィン組織切片からのプロテオーム解析の感度向上や凍結組織を用いた解析も十分でない等、28年度に計画した研究の推進が十分に実施できなかったことが大きな反省点である。
研究分担者である矢崎は平成28年度に、レーザーマイクロダイセッションを駆使してごく微小な組織切片上のアミロイド沈着からアミロイド線維を抽出して、移植を受けたFAP患者肝臓の眼内、眼外の様々の部位のアミロイド沈着における変異型と野生型TTRの構成比の直接的な解析に成功したのは予想以上の成果であった（Yoshinaga T. et al. Amyloid 2017）。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度以降も28年度の研究の継続が必要である。研究分担者八谷の移動に伴うALMDの移設は完了し、さらにもう一台稼働しているため、利用の促進を行う。また研究代表者の大学執行部での管理業務の軽減が期待できるために、研究の推進に注力する。
具体的には、新たにAApoAIIアミロイドーシスを発症したマウスを作成し、凍結切片を用いて、アミロイド沈着部位とその周辺部位をALMDを用いて採取して、SAMR1C-Apoa2c Tgマウスに、切り出した検体を投与し、２ヶ月後のアミロイド線維沈着を検出して伝播力を解析する。さらに、質量分析（LC-MS/MS)と Western blot法でのプロテオーム解析を推進する。そのためにはALMDとプロテオーム解析の感度の顕著な改善を目指して、研究グループ内外の協力を推進する。
研究分担者の矢崎は、28年度の成果をさらに発展させ、レーザーマイクロダイセッションと質量分析によるアミロイド蛋白質の解析技術を駆使して、ATTRや他のアミロイドーシスの病態解析を推進する。さらにTTRの構造安定化剤であるtafamidisの治療効果をアミロイド関連蛋白質の構成変化から明らかにする。
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| Causes of Carryover |
1)研究分担者の八谷如美博士の所属が変更（平成28年4月）となり、主要な研究装置である改良型レーザーカッター(AMLD)の移転（東京医科大学から東京都立産業技術研究センター）があったため、比較的長期にわたり使用できない期間が生じた。2）研究代表者の業務の多忙（学部長補佐やその他の大学管理業務）のために研究が遅延した。3）採取組織標本からのアミロイド関連蛋白質の抽出と質量分析の効率化と感度の向上に時間を要した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究分担者八谷の移動に伴うALMDの移設は完了し、また研究代表者の大学執行部での管理業務の軽減が予想できるために、研究の推進に注力する。具体的には、AApoAIIアミロイドーシスを発症したマウスを作成し、凍結切片を用いてアミロイド沈着部位とその周辺部位をALMDを用いて採取して、レシピエントマウスに切り出した検体を投与し、２ヶ月後のアミロイド線維沈着程度を検出して、沈着位置による伝播力の相違を解析する。さらに、質量分析法でのプロテオーム解析を推進する。そのために、ALMDとプロテオーム解析の感度の顕著な改善を目指して、研究グループ内外の協力を推進する。研究分担者の矢崎は、28年度の成果をさらに発展させ、レーザーマイクロダイセッションと質量分析によるアミロイド蛋白質の解析技術を駆使して、ATTRや他のアミロイドーシスの病態解析を推進する。
次年度使用額はこれらの研究実施のために使用する。
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Research Products
(27 results)
