CRISP/Cas9法を用いた多能性維持遺伝子破壊による癌幹細胞形成能の検証

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26670156
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 金田 安史 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10177537)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 癌幹細胞 / 多能性維持因子 / ゲノム編集法

Outline of Annual Research Achievements

抗癌剤などの様々なストレスに癌細胞が暴露されることにより、一部の癌細胞が治療抵抗性の遺伝子発現を誘導するが、その際、多能性維持因子のNanog, Sox2, Oct4 の発現が一過性に増強する。さらに癌幹細胞集団と考えられるスフェア形成時には、これら多能性維持因子の発現が急激に増強するが、スフェア形成を解除すると発現しなくなる。このことは、多能性維持因子が癌幹細胞形成に必須であることを示唆している。そこで、まずNanog遺伝子を完全にノックアウトした癌細胞をCRISPR/Cas9法により作成し、その癌細胞の腫瘍形成能、抗癌剤耐性能を評価し、癌幹細胞を決定づける遺伝子の同定を目指す。ヒト前立腺癌細胞DU145でCRISPR/Cas9を用いて、Nanog遺伝子をノックアウトを試みた。DU145にはNanog1の他に少なくとも10種類のpseudogeneがあることが分かり、その中でNanogP8のみが発現していた。そこで、Nanog1, NanogP8、それぞれのノックアウト細胞を作成した。いずれの細胞株も細胞増殖能は野生株と比較して差がなかったが、Snailの発現減少とE-cadherinの発現増強に伴う遊走能やSCIDマウスでの造腫瘍能はいずれも野生株と比較して著明に減少した。また抗癌剤のDocetaxel感受性も増大した。これらの形質はいずれもNanog1の遺伝子を導入して過剰発現させることで回復した。Nanog1, NanogP8のダブルノックアウト細胞を分離しようとしたが、312コロニーを検索したが1つも得られなかった。以上より、前立腺癌細胞ではNanog1, NanogP8が同等に働いて癌形質を維持しており、いずれも相補可能であるが、その発現は癌細胞の生存に必須であることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

癌幹細胞の特性の維持にNanogの発現が必須であることが明らかになり、実際にCRISPR/Cas9法によりNanog1, NanogP8それぞれの欠損株を得ることができた。従来癌細胞ではNanogp8が主として機能していることが報告されてきたが、我々の実験で、Nanog1, NanogP8は相補できることが分かった。

Strategy for Future Research Activity

Nanogの癌細胞に賦与している特性をさらに解明することにより、癌幹細胞の特性に新たな発見が期待できるので、得られた細胞株の機能の解明に重点を置く予定である。