2015 Fiscal Year Annual Research Report
人為的RNA Editingを利用した遺伝コード修復法の開発
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26670167
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| Research Institution | Japan Advanced Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
塚原 俊文 北陸先端科学技術大学院大学, マテリアルサイエンス研究科, 教授 (60207339)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Deaminase / RNA editing / MS2 / 活性ドメイン / guide RNA / 遺伝子修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、生体内のRNA editing機構を模倣し、核酸塩基の脱アミノ化酵素ADARファミリーの触媒部位とターゲット部位に相補的なguide RNAを細胞内に発現させ、酵素複合体の形成によって細胞内での人為的かつ部位特異的な塩基の脱アミノ化の実現を目指している。脱アミノ化によって標的塩基をA→IあるいはC→Uとすることができれば、結果として遺伝コードを修復することが可能であり、全く新しい遺伝性疾患の治療法となる。
ADARファミリーにはdeaminase活性を有するADAR1および2が存在する。この内、ADAR2には選択的splicingによりlong isoformとshort isoformが存在し、さらに配列内にAlu配列が挿入されたisoformも存在する。これらisoformの活性ドメインと、これらを細胞内でguide RNAと結合させるためのMS2システムの構築を終え、細胞内でのdeaminase-guide RNA複合体の作成に成功した。レポーター遺伝子としてGFPにNonsense変異を導入して、そのままでは蛍光を発しない変異体を作成し、上記のdaeminase活性ドメイン-MS2ペプチド、MS2-guide RNAの発現プラスミドと共にHEK293細胞に導入した。変異GFP mRNAが細胞内で編集（修復）され、緑色蛍光を発する細胞が蛍光顕微鏡で観察された。RNAの変異修復は、RT-PCR後にRFLPと増幅断片をクローニング後のsequencingによって確認し、UAG→UGGと修復されていることが示された。脱アミノ化による修復効率はADAR1>ADAR2-long (-Alu)>ADAR-long (+Alu)>ADAR2-shortの順であった。
一方、我々はADAR1活性部位cloneを構築中に選択的splicingによると思われる活性部位の周辺配列の一部を欠いたisoformを発見した。このADAR1-shortはguide RNAなしで変異GFP mRNAをRNA editing（修復）し、蛍光を有するGFPタンパク質を発現させることができることから、基質認識部位を欠いた活性部位であると考えられた。
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