細菌間で伝達されるRNAを記憶するDNAメモリの開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26670218
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 山本 章治 国立感染症研究所, その他部局等, 主任研究官 (80469957)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 細菌間コミュニケーション / 調節性ノンコーディングRNA / RIVET

Outline of Annual Research Achievements

細菌における調節性ノンコーディングRNA（regulatory non-coding RNA: rncRNA）は，標的mRNAの翻訳を抑制するタイプ（OFF型）と活性化するタイプ（ON型）に分けられる。当該年度はコレラ菌ON型rncRNAを検出する系の開発を試みた。この系はRIVET（Recombination-based in vivo expression technology）を応用したものであり，以下の二つの因子から構成される。一つは特異的なrncRNAを検出するセンサーである。これには任意rncRNAの標的部位をリゾルベース遺伝子tnpRに翻訳融合したものを用いる。二つ目は検出情報を記憶するメモリであるが，これにはTnpRによる不可逆的なDNA切り出し反応を利用する。つまり，特異的なrncRNAが存在する場合に限ってtnpRの翻訳が活性化され，産生されたリゾルベースがDNAの切り出し反応を触媒する系である。
１）センサープラスミドの構築：アラビノース誘導型ベクターpBAD30にtnpRの開始コドンを除いた部分をクローニングした。さらにON型rncRNAの標的部位をtnpRとフレームが合うように挿入し，様々なセンサープラスミドを構築した。
２）メモリ株の構築：同じ向きに並んだ二つのTnpR認識部位とそれらの間にクロラムフェニコール耐性遺伝子catおよびレバンスクラーゼ遺伝子sacBを組み込んだカセットをコレラ菌の染色体上に導入した。さらにこの株から各ON型rncRNA遺伝子を欠失させ，様々なメモリ株を構築した。センサープラスミドとメモリ株を適切に組み合わせた場合，菌体外から特異的なrncRNAが供給された時のみTnpRの発現が活性化し，cat-sacBカセットが切り出される。これにより最終的にはクロラムフェニコール感受性・スクロース耐性の表現型が付与される。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

当該年度の目標は，１）ON型rncRNA検出系の構築，２）OFF型rncRNA検出系の構築および３）両検出系の感度評価をコレラ菌，大腸菌，サルモネラ菌で行い，４）コレラ菌において伝達性rncRNAのスクリーニングする，というものであった。以上の目標のうち，コレラ菌において１）は達成したが，残りはほぼ手付かずであった。理由としてセンサープラスミドのベースとなる組換え酵素遺伝子の選定とそれにともなうメモリ株の構築に時間を費やしたことが挙げられる。

Strategy for Future Research Activity

今後は対象をコレラ菌に絞り，以下の解析を行う。
１）ON型rncRNA検出系の感度評価，２）伝達性を有するON型rncRNAのスクリーニング，３）OFF型rncRNA検出系の構築と感度評価，４）伝達性を有するOFF型rncRNAのスクリーニング，５）スクリーニングされた候補RNAの可視化

Causes of Carryover

年度末納品等にかかる支払いが平成27年4月1日以降となったため、
当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。
平成26年度分についてはほぼ使用済みである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

上記のとおり。