新規高性能ベクターを生体イメージングで評価し血友病遺伝子治療に応用するための研究

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26670264
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 福島 敬 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (30323299)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三輪 佳宏 筑波大学, 医学医療系, 講師 (70263845)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 血友病 / 遺伝子治療 / 脂肪細胞 / 生体イメージング / ＲＮＡベクター

Outline of Annual Research Achievements

使用する新規ＲＮＡベクターに搭載する第VIII血液凝固因子遺伝子のうち、完全型、Ｂドメイン欠失型および部分Ｂドメイン欠失型を選び、コドンの最適化を行ったのちに、完全型を含めて、その遺伝子を新規ベクターに搭載可能であることを確認した。
ヒト脂肪細胞に遺伝子を導入するための培養条件を検討し、それぞれの方法で得られた細胞に含まれる間葉系幹細胞の表面形質および分化能を比較検討し、質的な差がみられないことを確認した。
蛍光色素であるiRFPを膵限定的に発現させたマウスを作成した。これによって近赤外線検出装置を使用した生体イメージング技術を本研究に利用可能となった。即ち、新規ＲＮＡベクターを使用してiRFP遺伝子を導入したマウス脂肪細胞を、膵限定iRFP発現マウスに皮下移植し、体内動態を継時的に追跡評価するための方法を確立した。
血友病モデルマウス（第VIII血液凝固因子遺伝子ノックアウトマウス）を輸入し、繁殖させる一方で、日常的な飼育環境での出血症状等に関する確認作業を開始した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ベクターに搭載可能な遺伝子サイズを緩和可能であるか否かが最大のハードルであったが、完全型の第VIII血液凝固因子遺伝子の遺伝子をそのまま搭載することが可能であることを確認したことである。
ベクターの性能を評価する方法として蛍光色素遺伝子を利用するために、膵限定で蛍光色素iRFPを発現させて、この色素を異種蛋白として認識しないマウスを作成した。通常のエサは、蛍光物質を多量に含むため、解析上のノイズにならないエサの開発にも成功した。これによって蛍光色素遺伝子発現脂肪細胞を同系移植して、解剖せずに継時的に蛍光脂肪細胞の動態を確認することが可能になった。今後の動物実験を当初の計画以上に能率的に進めることが可能になった。
ヒト脂肪細胞の培養実験では、当初は天井培養の安定性が課題であったが、通常の培養法によって得られる間葉系幹細胞との質的差がないことを確認し、間葉系幹細胞自体を標的として遺伝子導入することによって、非常に効率的にヒトの細胞を用いた遺伝子導入・発現実験を行うことが可能になった。

Strategy for Future Research Activity

蛍光マウスを利用して、iRFP遺伝子発現脂肪細胞を同系移植し、同じ個体を継時的に生体イメージングで評価し、移植脂肪細胞の動態を追跡する。
血友病Ａモデルマウスに対して、マウス第VIII血液凝固因子遺伝子導入・発現脂肪細胞を同系移植し、薬理効果（治療効果）を評価する。
ヒト脂肪組織由来の細胞（間葉系幹細胞を含む）に、効率良く遺伝子導入・発現させるための培養条件を検討する。

Causes of Carryover

14,201円の繰り越しが生じた。主に消耗品購入の際の値下げ交渉によるものである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

主に消耗品（文具・ＯＡ関連物品類）購入のため、有効利用を計画している。