非アルコール性脂肪性肝炎を自然発症する新規モデル動物を利用した診断マーカーの探索

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26670273
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 鬼澤 浩司郎 筑波大学, 医学医療系, 教授 (60194578)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 蕨 栄治 筑波大学, 医学医療系, 講師 (70396612)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: NASH

Outline of Annual Research Achievements

本年度はDKOマウスがNASHを発症する32週齢，およびより病態の進行した62週齢のマウスの血清を用いて以下のように解析した．等電点電気泳動サンプルをImmobiline DryStrip gel (pH 3-10 non-linear, 13cm, GEヘルスケア)にアプラ イし,5時間ゲルの膨潤を行った.膨潤後のゲルをフォーカシングトレイにセットし,PROTEAN IEF Cell (Bio-Rad)にて等電点電気泳動を行った.等電点電気泳動後のストリップゲルを平衡化バッファー(6 M urea, 20% glycerol, 2% DTT, 2% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH8.8)に完全に浸し,45分間振とうして平衡化した.平衡化したゲルを10-18%ポリアクリルアミドグラジエントゲル(16 cm× 16 cm,バイオクラフト)にセットし,25 mA/枚 Constant Currentにて電気泳動を行った.泳動先端がゲル下端に到達した時 点で電気泳動を終了した.電気泳動後のゲルは固定液(10%メタノール,7%酢酸溶液)で30分間振とう後,SYPRO Ruby (Molecular Probe)にて遮光下 で一晩染色した.染色後のゲルは10%メタノール,7%酢酸溶液で十分洗浄した.電気泳動画像はMolecular Imager FX(Bio- Rad)を用いて取得した.二次元電気泳動の画像解析はPDQuest ver.7.30 (Bio-Rad)を用いて行った.野生型マウスとパターンの比較をして再現性を持って(n=3)増減するスポットを抽出した．その結果，有意にDKOマウスで発現の増加するものとして15スポット，減少するものとして10スポットが抽出された．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

再現性良くNASHマーカーになりうるDKOマウスのみで増減するタンパク質が25個得られた．

Strategy for Future Research Activity

25個のタンパク質について質量分析を行い，タンパク質の同定を同定する，ELISAアッセイ系を構築し，診断マーカーとしての妥当性を検証する．