Functional screening for novel molecules related to endothelial dysfunction in the ubiquitin system and the potential of their clinical application.

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26670365
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 樂木 宏実 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (20252679)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中神 啓徳 大阪大学, 医学系研究科, 寄附講座教授 (20325369) ; 鷹見 洋一 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (90621756)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 老化 / 血管内皮 / 酸化ストレス / ユビキチンシステム / 遺伝子機能スクリーニング

Outline of Annual Research Achievements

本研究では老化に伴う心血管疾患の進展において中心的な役割を担う血管内皮障害を鋭敏に反映するバイオマーカーやその病態に関連する創薬標的分子について血管内皮から分泌されるユビキチン系液性因子に焦点を絞り探索、機能解析し、更には臨床検体も用いて臨床応用の可能性を検証することを目的とする。
解析対象とする液性因子の探索に際してはHVJ-Eベクターを用いた遺伝子機能スクリーニング法を用いた。HUVECのcDNAライブラリーをHVJ-Eを用いてBHK細胞に遺伝子導入し、その培養上清をH2O2で刺激したヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)に添加後、培養上清中の酸化ストレスマーカー（8-isoprostane濃度）を測定した。更に8-isoprostaneを指標とした酸化ストレスが最も促進されたwellから抽出したプラスミドを大腸菌に形質転換、増幅させることによりシングルクローン化した後、個々のプラスミドをCOS7に遺伝子導入し、その培養上清をH2O2で刺激したNHDFに添加し8-isoprostaneを測定した。次に個々のプラスミドに含まれるcDNAのシークエンスを行い、候補遺伝子をリスト化し、その中から酸化ストレスを増強させる液性因子であり、かつユビキチンの基質蛋白であるANXA1を見出た。
ANXA1は抗炎症分子であると報告されているが、我々の検討では酸化ストレスにより細胞老化が誘導された環境においてはCalpain1の活性化よりANXA1がcleavageを受け、炎症作用を有するC末端側の断片が増加したためと想定している。今後、ANXA1のC末端断片が血管内皮の細胞老化を誘導し、細胞老化随伴分泌現象に関与する炎症性分子の分泌を増強することにより血管内皮障害を端緒とする加齢性の心血管疾患、代謝性疾患の病態への関与しているかについて基礎及び臨床的に検討していく予定である。