肝炎ウイルス複製を支持する新規肝癌由来培養細胞の樹立

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26670378
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 本多 政夫 金沢大学, 保健学系, 教授 (00272980)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: ウイルス培養細胞 / 幹細胞マーカー / 自然免疫

Outline of Annual Research Achievements

現在、我が国のHCV 感染の多くを占めるゲノタイプ1b型HCVの細胞培養系は存在せず、出現する薬剤耐性ウイルスの解析や薬剤耐性ウイルスに対する効果的なDAAの選択には、ゲノタイプ1b型HCVの培養細胞系の確立が必要である。本研究目的は、困難とされているゲノタイプ1b型HCVの培養系を確立し、DAA による効果的なHCV 治療を確立する上で必修の基盤的研究を行うことを目的とした。ゲノタイプ１ｂ型HCV感染症例の肝細胞癌手術検体から癌幹細胞マーカーEpCAM陽性細胞分画を単離し、培養皿で継代が可能な細胞株を樹立した（KH細胞）。KH細胞は当初HCV-RNA陽性を示したが、継体を続けるごとにHCV-RNAは減少し、検出されなくなった。しかしながら、JFH-1株やHJ3-5株（構造領域がH77由来、非構造領域がJFH株由来）のRNAを導入するとHCVが効率よく複製することが確認された。ウイルス蛋白の発現も免疫染色やウエスタンブロットで検出された。RNAトランスフェクション96時間後のHCV-RNAはHuh7.5細胞の1/5程度で有り、Huh7細胞と同等であった。興味深いことにKH細胞でのHCV増殖は特異なパターンを取り、RNAトランスフェクション48時間後まで、HCV-RNAは漸減を認め、48時間以降にHCVの再上昇が認められた。RNAセンサーであるRIG-Iの塩基配列解析ではKH細胞は変異を認めず、RNA導入直後のIFN-β、MX1、OASの発現はRIG-I nullのHuh7.5細胞と比較し数十倍の発現を示した。従って、KH細胞におけるHCVの漸減と再上昇は自然免疫によるインターフェロンシグナルによるHCV複製抑制とそこからの回避現象を見ているものと考えられた。遺伝子発現プロファイルの検討ではHuh-7、Huh-7.5細胞とKH細胞は全く異なる遺伝子発現を有し、染色体型もHuh-7、Huh-7.5細胞と異なっていた。このようにKH細胞は自然免疫機構を有し、HCV複製を支持する新しい細胞株であることが確認された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成２６年度の実験計画として挙げていた、KH細胞におけるHCV複製・感染を確認した。
さらに、用いられているHuh-7、Huh-7.5細胞とKH細胞の遺伝子発現プロファイルを比較し、KH細胞は全く異なる遺伝子発現を有することを確認した。
興味深いことにKH細胞はインターフェロン誘導遺伝子の発現や自然免疫分子の発現を保持しており、Huh-7やHuh-7.5細胞とHCV増殖のkineticsが異なることを明らかにした。

Strategy for Future Research Activity

平成２７年度では異なるゲノタイプのHCV感染患者血清を用いてKH細胞への感染実験を行い、ゲノタイプの特異性及び非特異性について検証する。
KM細胞の患者血清及びHCV陽性KM細胞からゲノタイプ1b型HCVの全長クローニングを試みる。得られたPCR産物はそれぞれ3個ずつクローンを得て、シークエンスしコンセンサス配列を得る。また5末端及び3末端の配列はRACE 法を用いてクローニングして配列を得る。全長をT7プロモーター下にクローニングすると同時に、構造領域部分をネオマイシンに置き換え、HCV-IRES-[ネオマイシン耐性遺伝子]-EMCV-IRES-[NS2-NS5B]-3’UTR と繋いだdicistronic のサブゲノムレプリコンを構築する。サブゲノムレプリコンをKH細胞に導入しネオマイシンにてセレクションを行い、ネオマイシン耐性コロニーを得る。ネオマイシン耐性コロニーから、RNA を抽出しHCV の[NS2-NS5B]-3’UTR 領域のシークエンスを行い適応変異(adaptive mutation)の有無を確認する。適応変異をサブゲノムレプリコンに新たに導入し、KH細胞でのレプリコンの増殖増加を確認する。以上の行程を繰り返すことでKH細胞に適応したNS2以下のHCV配列を得ることが出来る。次に構造領域部分をオリジナルクローンに入れ替え、完全長クローンを新たに作成しKH細胞に導入する。HCV-RNAの増加が認められれば細胞からHCV全長をクローニングし塩基配列を決定する。適応変異を同定し、全長クローンに適応変異を導入する。これらの行程を繰り返すことにより、ゲノタイプ1b型感染クローンとその複製を支持するKH細胞系を確立する。

Causes of Carryover

平成２６年度の研究成果は、これまでの研究に用いた試薬を使用することでおおむね可能であった。平成２７年度の研究計画は、HCVの全長クローニング、サブゲノムレプリコンの構築や全長シークエンスによる適応変異の確認など想定以上の消耗品の使用も予想される。そこで、平成26年度の残りの研究費を２７年度も使用できるようにした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

１.KM細胞の患者血清及びHCV陽性KM細胞からゲノタイプ1b型HCVの全長クローニングを試みる。　２.得られたPCR産物はそれぞれ3個ずつクローンを得て、シークエンスしコンセンサス配列を得る。また5末端及び3末端の配列はRACE 法を用いてクローニングして配列を得る。　　３.全長をT7プロモーター下にクローニングすると同時に、構造領域部分をネオマイシンに置き換え、HCV-IRES-[ネオマイシン耐性遺伝子]-EMCV-IRES-[NS2-NS5B]-3’UTR と繋いだdicistronic のサブゲノムレプリコンを構築する。　４.サブゲノムレプリコンをKH細胞に導入しネオマイシンにてセレクションを行い、ネオマイシン耐性コロニーを得る。　５.ネオマイシン耐性コロニーから、RNA を抽出しHCV の[NS2-NS5B]-3’UTR 領域のシークエンスを行い適応変異(adaptive mutation)の有無を確認する。適応変異をサブゲノムレプリコンに新たに導入し、KH細胞でのレプリコンの増殖増加を確認する。

Research Products

• [Journal Article] Small tRNA-derived RNAs are increased and more abundant than microRNAs in chronic hepatitis B and C. (2015)
  • Author(s): Selitsky SR, Baran-Gale J, Honda M, Yamane D, Masaki T, Fannin EE, Guerra B, Shirasaki T, Shimakami T, Kaneko S, Lanford RE, Lemon SM, Sethupathy P.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 5 Pages: 7675
  • DOI: 10.1038/srep07675.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Characteristics of hepatic fatty acid compositions in patients with nonalcoholic steatohepatitis. (2015)
  • Author(s): Yamada K, Mizukoshi E, Sunagozaka H, Arai K, Yamashita T, Takeshita Y, Misu H, Takamura T, Kitamura S, Zen Y, Nakanuma Y, Honda M, Kaneko S.
  • Journal Title: Liver Int. Volume: 35 Pages: 582-590
  • DOI: 10.1111/liv.12685.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Genome-wide association study identifies a PSMD3 variant associated with neutropenia in interferon-based therapy for chronic hepatitis C. (2015)
  • Author(s): Iio E, Matsuura K, Nishida N, Maekawa S, Enomoto N, Nakagawa M, Sakamoto N, Yatsuhashi H, Kurosaki M, Izumi N, Hiasa Y, Masaki N, Ide T, Hino K, Tamori A, Honda M, Kaneko S, Tanaka Y. et al
  • Journal Title: Hum Genet. Volume: 134 Pages: 279-89
  • DOI: 10.1007/s00439-014-1520-7.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Autoantibody status and histological variables influence biochemical response to treatment and long-term outcomes in Japanese patients with primary biliary cirrhosis. (2015)
  • Author(s): Nakamura M, Kondo H, Tanaka A, Komori A, Ito M, Yamamoto K, Ohira H, Zeniya M, Hashimoto E, Honda M, Kaneko S, Ueno Y, Kikuchi K, Shimoda S, Harada K, Arai K, Miyake Y, Abe M, Taniai M, Saibara T, Sakisaka S, Takikawa H, Onji M, Tsubouchi H, Nakanuma Y, Ishibashi H.
  • Journal Title: Hepatol Res. Volume: 45 Pages: 846-855
  • DOI: 10.1111/hepr.12423.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Blood neutrophil to lymphocyte ratio as a predictor in patients with advanced hepatocellular carcinoma treated with hepatic arterial infusion chemotherapy. (2015)
  • Author(s): Terashima T, Yamashita T, Iida N, Yamashita T, Nakagawa H, Arai K, Kitamura K, Kagaya T, Sakai Y, Mizukoshi E, Honda M, Kaneko S.
  • Journal Title: Hepatol Res. Volume: 45 Pages: 949-959
  • DOI: 10.1111/hepr.12436.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Impaired interferon signaling in chronic hepatitis C patients with advanced fibrosis via the transforming growth factor beta signaling pathway. (2014)
  • Author(s): Shirasaki T, Honda M, Shimakami T, Murai K, Shiomoto T, Okada H, Takabatake R, Tokumaru A, Sakai Y, Yamashita T, Lemon SM, Murakami S, Kaneko S.
  • Journal Title: Hepatology. Volume: 60(5) Pages: 1519-30
  • DOI: 10.1002/hep.27277.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Feasibility and efficacy of hepatic arterial infusion chemotherapy for advanced hepatocellular carcinoma after sorafenib. (2014)
  • Author(s): Terashima T, Yamashita T, Arai K, Sunagozaka H, Kitahara M, Nakagawa H, Kagaya T, Mizukoshi E, Honda M, Kaneko S.
  • Journal Title: Hepatol Res. Volume: 44(12) Pages: 1179-85
  • DOI: 10.1111/hepr.12266.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The effects of ezetimibe on non-alcoholic fatty liver disease and glucose metabolism: a randomised controlled trial. (2014)
  • Author(s): Takeshita Y, Takamura T, Honda M, Kita Y, Zen Y, Kato KI, Misu H, Ota T, Nakamura M, Yamada K, Sunagozaka H, Arai K, Yamashita T, Mizukoshi E, Kaneko S.
  • Journal Title: Diabetologia. Volume: 57(5) Pages: 878-90
  • DOI: 10.1007/s00125-013-3149-9.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] P53, hTERT, WT-1, and VEGFR2 are the most suitable targets for cancer vaccine therapy in HLA-A24 positive pancreatic adenocarcinoma. (2014)
  • Author(s): Terashima T, Mizukoshi E, Arai K, Yamashita T, Yoshida M, Ota H, Onishi I, Kayahara M, Ohtsubo K, Kagaya T, Honda M, Kaneko S.
  • Journal Title: Cancer Immunol Immunother Volume: 63(5) Pages: 479-89
  • DOI: 10.1007/s00262-014-1529-8.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The acyclic retinoid peretinoin inhibits hepatitis C virus replication and infectious virus release in vitro. (2014)
  • Author(s): Shimakami T, Honda M, Shirasaki T, Takabatake R, Liu F, Murai K, Shiomoto T, Funaki M, Yamane D, Murakami S, Lemon SM, Kaneko S.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 4 Pages: 4688
  • DOI: 10.1038/srep04688.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Hepatic interferon-stimulated genes are differentially regulated in the liver of chronic hepatitis C patients with different interleukin 28B genotypes. (2014)
  • Author(s): Honda M, Shirasaki T, Shimakami T, Sakai A, Horii R, Arai K, Yamashita T, Sakai Y, Yamashita T, Okada H, Murai K, Nakamura M, Mizukoshi E Kaneko S.
  • Journal Title: Hepatology. Volume: 59(3) Pages: 828-38
  • DOI: 10.1002/hep.26788.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Gd-EOB-DTPA-enhanced magnetic resonance imaging and alpha-fetoprotein predict prognosis of early-stage hepatocellular carcinoma. (2014)
  • Author(s): Yamashita T, Kitao A, Matsui O, Hayashi T, Nio K, Kondo M, Ohno N, Miyati T, Okada H, Yamashita T, Mizukoshi M, Honda M, Nakanuma Y, Takamura H, Ohta T, Nakamoto Y, Yamamoto M, Takayama T, Arii S, Wang XW, Kaneko S.
  • Journal Title: Hepatology. Volume: 60(5) Pages: 1674-85
  • DOI: 10.1002/hep.27093.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] New susceptibility and resistance HLA-DP alleles to HBV-related diseases identified by a trans-ethnic association study in Asia. (2014)
  • Author(s): Nishida N, Sawai H, Kashiwase K, Minami M, Sugiyama M, Seto WK, Yuen MF, Posuwan N, Poovorawan Y, Ahn SH, Han KH, Matsuura K, Tanaka Y, Kurosaki M, Asahina Y, Izumi N, Kang JH, Hige S, Ide T, Yamamoto K, Sakaida I, Murawaki Y, Itoh Y, Tamori A, Orito E, Hiasa Y, Honda M, et al.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 9(2) Pages: e86449
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0086449.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The transcription factor SALL4 regulates stemness of EpCAM-positive hepatocellular carcinoma. (2014)
  • Author(s): Zeng SS, Yamashita T, Kondo M, Nio K, Hayashi T, Hara Y, Nomura Y, Yoshida M, Hayashi T, Oishi N, Ikeda H, Honda M, Kaneko S.
  • Journal Title: J Hepatol. Volume: 60(1) Pages: 127-34
  • DOI: 10.1016/j.jhep.2013.08.024.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] LECT2 Specifically Induced by IL28B Regulates Interferon Response and HCV Replication. (2014)
  • Author(s): Shirasaki T, Honda M, Shimakami T, Murai K, Shiomoto T, Misu H, Takamura T, Lemon SM, Murakami S, Kaneko S.
  • Organizer: 21st International Symposium on Hepatitis C Viruses (HCV2014)
  • Place of Presentation: バンフ（カナダ）
  • Year and Date: 2014-09-09