Development of molecular diagnostic system for the prediction of therapeutic effect in liver cancer

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26670387
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 奥瀬 千晃 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (00318940)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 博幸 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 准教授 (40332910) ; 伊東 文生 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (90223180)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 肝細胞癌 / Sorafenib / 治療効果予測 / DNAメチル化 / VEGFR / PDGFR / pyrosequencing

Outline of Annual Research Achievements

肝細胞癌においてはRaf-1 シグナル伝達経路とVEGFシグナル伝達経路が重要な役割を担うが、Sorafenib治療に対して30-40％の無効例が認められる。治療効果予測因子の確立により、効果的な患者選択と治療遂行が可能となるが、現状ではSorafenibの治療効果予測に有用な指標は存在しない。本研究では、Sorafenibの治療効果予測因子確立を目的として、研究を行った。
シグナル受容体であるVEGFR とPDGFR のDNAメチル化解析に関し、肝癌細胞株の脱メチル化剤処理による再発現解析に基づき、機能的意義を有するDNAメチル化を検討した。その結果、いくつかの重要なCpG領域を明らかにした。これに基づき、primerの設計を行い、biotinated-primerを用いて、サンプルDNAをビオチン化させPCR増幅するpyrosequencing解析を行った。これにより、DNAメチル化と遺伝子発現が相関することを明らかにした。さらに複数の肝細胞癌細胞株において、DNAメチル化と遺伝子発現との相関を明らかにした。
さらに、腫瘍組織での検討では、肝細胞癌組織切片から腫瘍部、非腫瘍部を、laser microdissection and pressure catapulting (LMPC)システムを用いて別々に採取できた。抽出したDNAを用いて、Epitecktによりbisulfite 処理を施し、VEGFR とPDGFR のDNAメチル化をpyrosequencing法で解析し、遺伝子発現との相関を明らかにすることができた。DNAメチル化には、heterogeneityがあることが明らかになり、末梢血中遊離DNAでのメチル化検出につながる基盤的成果を得た。