2015 Fiscal Year Annual Research Report
タイチンアイソフォームの発現比率と拡張型心筋症の関係の解明
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26670398
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
黒柳 秀人 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 准教授 (30323702)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | タイチン / RBM20 / 拡張型心筋症 / リン酸化 / スプライシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、RBM20によるTTN遺伝子の選択的スプライシング制御機構を明らかにして、拡張型心筋症患者に見出されるRBM20の変異がスプライシング制御能に与える影響を明らかにするとともに、タイチンアイソフォームの発現比率を人為的に操作することを目指した。
RBM20で患者の変異が集中するRSRSP配列の2つのセリン残基が共にリン酸化され、それがRBM20の核移行とTTNレポーターのスプライシング制御に必須であるが、RNA結合ドメインと推定される２つのZnフィンガードメインと１つのRNA認識モチーフドメインは細胞内局在やスプライシング制御能にそれほど寄与せず、RSRSP配列の重要性が際立った。
RSRSP配列変異型RBM20を強制的に核移行させたところ、TTNレポーターのスプライシング制御能をある程度回復したことから、RSRSP配列はRBM20の核移行に必須であってスプライシング制御には直接は関与しないことが明らかとなった。TTNレポーターで進化的に保存された配列を欠失させる実験では、シスエレメントの同定に至らなかった
リン酸化ペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作製し、培養細胞に発現させた野生型RBM20のRSRSP配列がリン酸化されていることを確認し、細胞抽出液からリン酸化RBM20を免疫沈降できることを確認した。しかし、他のリン酸化タンパク質との非特異的に反応も強く、マウスの心臓の内在性のRBM20を検出するには至らなかった。
プラスミドベクターで作製した蛍光二色蛍光レポーターミニ遺伝子を安定発現する細胞株を作製し、RBM20の発現によりスプライシングが心筋型に変化して蛍光タンパク質の発現比率が変化することを確認した。
野生型および変異型RBM20を安定発現する細胞株を作製し、候補となるリン酸化酵素の特異的阻害剤で処理したが、核局在やリン酸化への影響は見られなかった。
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