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2014 Fiscal Year Research-status Report

補体因子MASP-1/3を標的とする新規製剤の開発とSLEモデル動物への治療効果

Research Project

Project/Area Number 26670478
Research InstitutionFukushima Medical University

Principal Investigator

関根 英治  福島県立医科大学, 医学部, 教授 (40363759)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 町田 豪  福島県立医科大学, 医学部, 助教 (80583632)
Project Period (FY) 2014-04-01 – 2016-03-31
Keywords補体 / 第二経路 / レクチン経路 / MASP-1/3 / MAp44
Outline of Annual Research Achievements

①MASP-1/3遺伝子ノックアウトのC57BL/6マウスにリコンビナントMASP-1/3を免疫し、モノクローナル抗体の作製を試みたが、MASP-1/3に対する抗体は産生されなかった。その理由として、MASP-1/3遺伝子のノックアウト部位をスキップして、MASP-1/3遺伝子ノックアウトマウスでもMASP-1/3の微量タンパクが産生され、これが免疫寛容を誘導してしまったためと考えられた。
②MASP-1/3を阻害する融合タンパクMAp44-Igの開発
C57BL/6マウスの心臓、肝臓からtotal RNAを抽出し、RT-PCRでMAp44のDNA配列を増幅、大腸菌でクローニングしvector pFUSE-IgG1-Fc1にMAp44遺伝子を組み込んでCHO細胞にTransfectionした。MAp44-Ig融合タンパクの産生を確認し、4M NaCl条件下でPritein Aによる免疫沈降法にて融合タンパクの回収を行った。融合タンパクの機能解析として、mannan coat plateでのC3 deposition、C4 depositionが阻害されるか検証したところ、いずれも融合タンパクを加えるとdepositionが増加してしまい、逆に補体が活性化されてしまう結果となった。
③MASP-1/3を阻害する融合タンパクMAp44-PAの開発
MAp44-Igで補体が活性化された結果であったため、IgG1の影響の可能性を考え別のtagを有するvectorで再度MAp44の融合タンパクを作成した。pFUSE-IgG1-Fc1に組み込んだMAp44のDNA配列を制限酵素で切り出し、vector pCAG-Bsd PA tag-Cへ組み込んだ。PA tagに対するaffinity chromatographyで融合タンパクを回収した。MAp44-PA融合タンパクはmannan coat plateでのC3 deposition阻害作用が確認された。現在、融合タンパクを量産しさらに解析中である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初予定した、抗MASP-1/3モノクローナル抗体と、MASP-1/3を阻害する融合タンパクMAp44-Igの開発がうまくいかなかったため、新たにPA-tagを付加したMAp44-PAを開発し、 vitroの検査でのパイロットスタディーでは、MAp44-PAによるレクチン経路の阻害作用が確認されたため。

Strategy for Future Research Activity

当初予定した、抗MASP-1/3モノクローナル抗体と、MASP-1/3を阻害する融合タンパクMAp44-Igの開発がうまくいかなかったため、新たにPA-tagを付加したMAp44-PAを開発した。
パイロットスタディーでは、in vitroの検査でMAp44-PAによるレクチン経路の阻害作用が確認された。第二経路の阻害作用の有無の検討を行うため、現在、MAp44-PAタンパクを量産しさらに解析中を進める予定である。

  • Research Products

    (6 results)

All 2014

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (4 results) (of which Invited: 2 results)

  • [Journal Article] Autoantibody-secreting marginal zone B cells develop significantly in lupus-prone MRL/lpr mice but not associated with expression of IFN-γ-receptor-1 on their surfaces.2014

    • Author(s)
      Takeshi Machida, Natsumi Sakamoto, Tomoko Omori, and Hideharu Sekine
    • Journal Title

      Proceedings of the Japanese Society for Immunology

      Volume: 43 Pages: 189

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A dual role for IFN-γ in development of peripheral B cells in lupus-prone MRL/lpr mice.2014

    • Author(s)
      Takeshi Machida, Natsumi Sakamoto, Gary S. Gilkeson, and Hideharu Sekine
    • Journal Title

      Arthritis Rheum

      Volume: 66 Pages: S857-S858

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Autoantibody-secreting marginal zone B cells develop significantly in lupus-prone MRL/lpr mice but not associated with expression of IFN-γ-receptor-1 on their surfaces.2014

    • Author(s)
      Takeshi Machida, Natsumi Sakamoto, Tomoko Omori, and Hideharu Sekine
    • Organizer
      第43回日本免疫学会学術集会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館
    • Year and Date
      2014-12-10 – 2014-12-12
  • [Presentation] 免疫学と臨床医学の接点 ~自然免疫(補体)を中心に~2014

    • Author(s)
      関根英治
    • Organizer
      福島県立医科大学光が丘協議会ステップアップセミナー
    • Place of Presentation
      福島県国見町
    • Year and Date
      2014-11-28 – 2014-11-28
    • Invited
  • [Presentation] Takeshi Machida, Natsumi Sakamoto, Gary S. Gilkeson, and Hideharu Sekine, A dual role for IFN-γ in development of peripheral B cells in lupus-prone MRL/lpr mice.2014

    • Author(s)
      Takeshi Machida, Natsumi Sakamoto, Gary S. Gilkeson, and Hideharu Sekine
    • Organizer
      2014-Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology
    • Place of Presentation
      Boston, MA, USA
    • Year and Date
      2014-11-13 – 2014-11-18
  • [Presentation] 炎症性疾患に自然免疫はどう関与すのか~補体の役割を中心に~2014

    • Author(s)
      関根英治
    • Organizer
      第23回日本集中治療医学会東北地方会
    • Place of Presentation
      山形県山形市
    • Year and Date
      2014-06-28 – 2014-06-28
    • Invited

URL: 

Published: 2016-05-27  

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