母体ストレスと胎児側因子の交互作用による脳発達障害モデルの確立

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26670512
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 福田 敦夫 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50254272)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: ストレス / 脳発達 / WNK / KCC2 / GABA / コルチコステロン / GAD / 低栄養

Outline of Annual Research Achievements

１.GAD67-GFP knock-in マウスへの低栄養負荷：母獣の摂餌制限（-30%）を妊娠10.5－18.5日に行った胎生期低栄養モデルで、GAD67遺伝子型‐低栄養の相互作用を野生型母体とGAD67ヘテロ母体の低栄養モデル各々に関して、野生型胎仔とGAD67ヘテロ胎仔を用い母仔双方で検討した。母体血中コルチコステロン（CORT）濃度は、栄養制限によって野生型でのみ有意に上昇し、GABAがCRH分泌増加に働く可能性が示唆された。母体CORTの影響を排するため、ヘテロ母体由来の胎仔で検討した結果、ACTH、CORT値はヘテロ仔でのみ有意に上昇し、胎仔では母体と逆のGAD67‐低栄養相互作用が認められた。
２. Wnk3 KOマウスの大脳皮質神経細胞の電気生理学的解析：WNK-SPAK/OSR1-NKCC1/KCC2のリン酸化カスケードはClホメオスタシスを変化させGABA作動性抑制のトーンを変化させるので、Wnk3 KOマウスの神経細胞の全般的な電気生理学的特性の変化を解析した。静止膜電位が深く、膜抵抗減少、発火閾値上昇、発火間膜電位上昇により、連続発火など神経興奮性が低下していた。また、抑制性シナプス活動が興奮性シナプス活動に比べ上昇していた。
３．食餌塩分量の変化にWNK-SPAK/OSR1-NKCC1/KCC2のリン酸化カスケードが素早く応答する。視床下部はKCC2が最も早く胎生期から発現するので、WNK1-SPAK/OSR1が下流のKCC2のリン酸化を介して、どのようにCl-ホメオスタシスを制御し、高食塩食や低栄養時のGABA作用を変化させ交互作用や神経発達に影響するのかを、KCC2のリン酸化部位特異的に変異を導入し持続的にKCC2のリン酸化状態を疑似できる変異マウスをKahle (Yale大) との共同研究で入手し検討した結果、神経機能発達に異常が見られた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度の成果として、学会での公開もできている。27年度計画としては、大部分を実行でき、ほぼ予定通りの目的を達成できた。加えて、塩分負荷モデルより直接的なリン酸化部位変異KCC2発現マウスの系を立ち上げることが出来たので、残りの計画を28年度年度で達成するめどができた。

Strategy for Future Research Activity

１．GAD67ヘテロ欠損母体ストレスモデル胎仔脳の網羅的DNAメチル化解析：当該モデルではパルブアルブミン陽性GABA細胞が特異的に減少する。RRBS法でのパイロットスタディの結果、GABA細胞の発生・移動・シナプス可塑性に関連する、Dlx2, Fktn, Nkx6-2、Cdk5r2, Pax6などの遺伝子のメチル化が亢進していた。これらの蛋白質の発現変化を確認するとともに、GABA機能関連分子の機能的変化を電気生理学的に解析する。
２．KCC2のWNK-SPAK-OSR１によるリン酸化部位に変異を導入したマウス胎仔脳の神経細胞の発生・移動・神経機能の解析：EdUによる細胞分裂アッセイで導入当日に発生した細胞（EdU陽性）を同定し、脳室帯での皮質板細胞、内側線条体原基でのGABA細胞、第三脳室周辺でのCRH細胞などの発生と移動を解析する。また、２光子顕微鏡でシナプス形態を観察する。
３．タウリントランスポーターKOマウスの大脳皮質神経細胞の電気生理学的解析：タウリンはWNK-SPAK/OSR1-NKCC/KCCのリン酸化カスケードを活性化する。低栄養でもタウリンが減少し、また塩分や細胞容積の調節と関係する。タウリントランスポーターKOマウスにおける細胞内タウリンが減少した状態での神経発達を、大脳皮質神経細胞の膜特性およびシナプス特性で解析する。また、タウリン欠乏によるリン酸化カスケードの変化を網羅的リン酸化アッセイで解析する。
４．前年度に見出した所見の検討：母体ではGABAがCRH分泌増加に働く可能性が示唆されたので、正中隆起へのCRHニューロン軸索終末へのGABAの投射の有無、ある場合はその投射元、さらにGABA作用が興奮性か否かを、２光子顕微鏡によるCaイメージングで検討する。また、胎仔では母体と逆の現象が認められたので、上記の発達過程を胎仔でも確認する。

Causes of Carryover

当初は物品費￥738,000・旅費￥108,000・その他￥54,000を計上し混合ガス・実験マウス等の購入及びマウス飼育管理費・論文投稿料に充てていたが、実験に使用する消耗品については大部分が汎用的な物品であったため、在庫分から先に使用した。在庫分が存外に多かったため、本来新規購入に充てる予定であった物品費を次年度に回すこととした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

主に消耗品費や旅費として利用する。また、現在実験に使用している現有備品が老朽化しており、もしも不具合が生じて実験の遂行に支障が生じた場合は、その修理もしくは代替品の購入に要する費用の一部とする。

Research Products

• [Journal Article] De novo KCNB1 mutations in infantile epilepsy inhibit repetitive neuronal firing. (2015)
  • Author(s): Saitsu H#, Akita T#, Tohyama J, Goldberg-Stern H, Kobayashi Y, Cohen R, Kato M, Ohba C, Miyatake S, Tsurusaki Y, Nakashima M, Miyake N, Fukuda A and Matsumoto N.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 5 Pages: ‐
  • DOI: 10.1038/srep15199
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] KCC2-mediated regulation of respiration-related rhythmic activity during postnatal development in mouse medulla oblongata. (2015)
  • Author(s): *Okabe, A., Shimizu-Okabe, C., Arata, A., Konishi, S., Fukuda, A. and Takayama, C.
  • Journal Title: Brain Research Volume: 1601 Pages: 31-39
  • DOI: 10.1016/j.brainres.2015.01.007
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development and regulation of chloride homeostasis in the central nervous system. (2015)
  • Author(s): Watanabe, M., *Fukuda, A.
  • Journal Title: Frontiers in Cellular Neuroscience Volume: 9 Pages: ‐
  • DOI: 10.3389/fncel.2015.00371
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Aberrant oscillation property of Perkinje cells is caused by decreased tonic inhibitionin granule in granule cells in mice model of Angelman syndrome. (2016)
  • Author(s): Egawa, K. and Fukuda, A.
  • Organizer: 第93回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2016-03-23
• [Presentation] De novo Kv2.1 mutants causing infantile generalized seizures and psychomotor developmental delay inhibit repetitive neuronal firing. (2016)
  • Author(s): Akita, T., Saitsu, H., Matsumoto, N. and Fukuda, A.
  • Organizer: 第93回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2016-03-23
• [Presentation] 発生期マウス大脳皮質においてGABAA受容体と母体由来タウリンは神経前駆細胞の時系列的性質変化を制御する. (2016)
  • Author(s): 栃谷史郎, 古川智範, 伊藤崇志, 松島芳隆, 小島俊男, 松崎秀夫, 福田敦夫.
  • Organizer: 第2回国際タウリン研究会日本部会
  • Place of Presentation: アオッサ福井（福井県福井市）
  • Year and Date: 2016-03-05
• [Presentation] Taurine is involved in the temporal regulation of the properties of neural progenitors in the mouse developing cortex. (2015)
  • Author(s): 栃谷史郎, 古川智範, 伊藤崇志, 小島俊男, 松崎秀夫, 福田敦夫.
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県・神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-02
• [Presentation] CRH放出機構における新規GABA作用の発見. (2015)
  • Author(s): 福田敦夫, 柿沢圭亮, 渡部美穂, 大川雄太, 大石敏弘, 山下美保, 柳川右千夫, 沖隆.
  • Organizer: 第42回日本脳科学会
  • Place of Presentation: ANAホリデイ・イン リゾート宮崎（宮崎県・宮崎市）
  • Year and Date: 2015-11-12
• [Presentation] 出生前ストレス曝露による生後大脳皮質におけるGABA細胞とペリニューラルネットの減少. (2015)
  • Author(s): 福田敦夫.
  • Organizer: 第13回糖鎖科学コンソーシアムシンポジウム
  • Place of Presentation: ウインクあいち（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-20
  • Invited
• [Presentation] Dual effects of serotoninergic inputs on the local circuits regulating the corticotropin-releasing factor neurons in the paraventricular nucleus of the hypothalamus: an electrophysiological study using the CRF-VenusΔNeo mouse. (2015)
  • Author(s): Sato, T., Sugiya, T., Fuse, T., Uchida, K., Sugimoto, N., Abe, M., Yamazaki, M., Fukuda, A., Sakimura, K. and Itoi, K.
  • Organizer: Society for Neuroscience 2015
  • Place of Presentation: Chicago(USA)
  • Year and Date: 2015-10-19
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] CRHニューロン制御におけるGABAの新たな役割についての検討. (2015)
  • Author(s): 柿沢圭亮，渡部美穂，大川雄太，大石敏弘，山下美保，柳川右千夫，沖 隆，福田敦夫.
  • Organizer: 第42回日本神経内分泌学会・第23回日本行動神経内分泌研究会・合同学術集会
  • Place of Presentation: 仙台市戦災復興記念館（宮城県・仙台市）
  • Year and Date: 2015-09-19
• [Presentation] Taurine concentration and distribution in brain of frontaltemporal lobar degeneration patients. (2015)
  • Author(s): Matsushita, S., Masaki, N, Kondo, T., Takei, S., Akatsu, H., Akita, T., Sugiyama, E., Fukuda, A., Yao, I. and Setou, M.
  • Organizer: 第40回日本医用マススペクトル学会年会
  • Place of Presentation: アクトシティ浜松（静岡県・浜松市）
  • Year and Date: 2015-09-17
• [Presentation] Visualization of the glutamate release in the plexiform layers of the mouse retina. (2015)
  • Author(s): Ohkuma, M., Horio, K., Kaneda, M., Yoshida, S., Fukuda, A. and Miyachi, E.
  • Organizer: 第38回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場・展示場（兵庫県・神戸市）
  • Year and Date: 2015-07-30
• [Presentation] Persistent reduction of MHC class I in dopamine neurons contributes to robust cocaine-seeking behavior. (2015)
  • Author(s): Murakami, G., Fukuda, A., Iwashita, T. and Nakahara, D.
  • Organizer: 第38回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場・展示場（兵庫県・神戸市）
  • Year and Date: 2015-07-29
• [Presentation] A novel role of GABA in the release of CRH in the hypothalamo-pituitary pathway. (2015)
  • Author(s): Kakizawa, K., Watanabe, M., Yanagawa, Y., Oki, Y. and Fukuda, A.
  • Organizer: 第38回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場・展示場（兵庫県・神戸市）
  • Year and Date: 2015-07-28
• [Book] GABAとその受容体, 臨床てんかん学 (2015)
  • Author(s): 福田敦夫
  • Total Pages: 671(66-71)
  • Publisher: 医学書院
• [Remarks] 浜松医科大学医学部神経生理学講座ホームページ
  • URL: http://www.hama-med.ac.jp/uni_education_igakubu_igaku_seiri1.html