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2015 Fiscal Year Research-status Report

部位特異的制限酵素I-PpoIを応用したPCRによる染色体転座検出法の開発

Research Project

Project/Area Number 26670549
Research InstitutionGunma University

Principal Investigator

柴田 淳史  群馬大学, 先端科学研究指導者育成ユニット, 助教 (30707633)

Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
KeywordsDNA修復 / 染色体転座 / ゲノム不安定性
Outline of Annual Research Achievements

二次発がんを導く重篤な突然変異として染色体転座がある。転座はDNA二本鎖切断後に導かれるが、転座発生までのステップは複雑であり様々なDNA修復因子が関わるため、患者の遺伝的背景からその予測をすることは極めて困難である。一方、現在主流の放射線誘発染色体転座を検出する方法は、熟練した技術が必要であり測定完了まで数日を要する。本研究ではPCRを用いた新染色体転座検出系を開発することで、細胞内における放射線誘発染色体転座頻度を簡便かつ短時間に予測する方法の確立を目指す。本研究では転座発生原因となる放射線照射誘発DNA二本鎖切断(DSB)を模倣且つ制御するために、15bpと長い認識配列を有するゲノム内在性制限酵素I-PpoIを用いる。
本年度は全細胞集団においてI-PpoIを同時期に誘導するため、細胞はタモキシフェン誘導体4-0HT(4-hydroxytamoxifen)で誘導可能なI-PpoI-HT1080細胞を樹立した。4-OHT誘導DSB量を調整するため、4-OHTの濃度及び処理時間の条件検討を行った。4-OHTの濃度は、転座が発生するまでの期間である72時間以内に細胞死が起こらないことを基準として設定を行った。条件検討を行う際に、DSB量の評価は蛍光免疫染色によるgH2AX fociを用いて行った。その結果、300nM 4-OHTの4時間転嫁が細胞に適度のDSBを誘導できることが確認出来た。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究の基盤となるI-PpoI-HT1080細胞が樹立することができ、DSB誘導条件が決定したことから、研究計画に沿って順調に進展していると考えている。またDSB切断は、DSBマーカーであるgH2AX、DNA切断部位におけるPCRにより確認することが出来た。しかし転座を検出するためのプライマーセットではPCRによる増幅が認められなかった。すなわち、本研究で標的にしていた染色体間での転座の検出は現在のプライマーセットでは検出できないことが明らかになった。

Strategy for Future Research Activity

適正な4-OHT濃度及び処理時間を用いて、今後は異なるプライマーセットを用いて転座部位でのPCRを試みる。また数時間のみの一過性I-PpoI発現を可能にするため、精製I-PpoI酵素を細胞内に導入するPCR転座検出法の確立も併せて進めていく。

Causes of Carryover

前年度の後半に計画していたリアルタイムPCR解析へ向けた条件検討が遅れたため、解析に必要な試薬を購入しなかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

リアルタイムPCR解析に必要な試薬を購入する。

  • Research Products

    (16 results)

All 2016 2015 Other

All Journal Article (6 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 5 results,  Open Access: 2 results) Presentation (7 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 4 results) Remarks (3 results)

  • [Journal Article] Visualization of complex DNA double-strand breaks in a tumor treated with carbon ion radiotherapy2016

    • Author(s)
      Takahiro Oike, Atsuko Niimi, Noriyuki Okonogi, Kazutoshi Murata, Akihiko Matsumura, Shin-Ei Noda, Daijiro Kobayashi, Mototaro Iwanaga, Keisuke Tsuchida, Tatsuaki Kanai, Tatsuya Ohno, Atsushi Shibata & Takashi Nakano
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 6 Pages: -

    • DOI

      10.1038/srep22275

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Carbon-ion beams effectively induce growth inhibition and apoptosis in human neural stem cells compared with glioblastoma A172 cells2015

    • Author(s)
      Mayu Isono, Yukari Yoshida, Akihisa Takahashi, Takahiro Oike, Atsushi Shibata, Yoshiki Kubota, Tatsuaki Kanai, Tatsuya Ohno, and Takashi Nakano
    • Journal Title

      Journal of Radiation Research

      Volume: 56(5) Pages: 856-861

    • DOI

      10.1093/jrr/rrv033

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The EGFR mutation status affects the relative biological effectiveness of carbon-ion beams in non-small cell lung carcinoma cells2015

    • Author(s)
      Napapat Amornwichet, Takahiro Oike, Atsushi Shibata, Chaitanya S. Nirodi, Hideaki Ogiwara, Haruhiko Makino, Yuka Kimura, Yuka Hirota, Mayu Isono, Yukari Yoshida, Tatsuya Ohno, Takashi Kohno & Takashi Nakano
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 5 Pages: -

    • DOI

      10.1038/srep11305

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Other Determinants of Sensitivity2015

    • Author(s)
      Naoyuki Okita and Atsushi Shibata
    • Journal Title

      PARP Inhibitors for Cancer Therapy

      Volume: 83 Pages: 363-379

    • DOI

      10.1007/978-3-319-14151-0_15

  • [Journal Article] SETDB1, HP1 and SUV39 promote repositioning of 53BP1 to extend resection during homologous recombination in G2 cells2015

    • Author(s)
      Meryem Alagoz, Yoko Katsuki, Hideaki Ogiwara, Tomoo Ogi, Atsushi Shibata, Andreas Kakarougkas, and Penny Jeggo
    • Journal Title

      Nucleic Acids Research

      Volume: 43(16) Pages: 7931-7944

    • DOI

      10.1093/nar/gkv722

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] RAD51 and BRCA2 promote oncolytic adenovirus type 5 activity in ovarian cancer2015

    • Author(s)
      Laura A. Tookman, Ashley K. Browne, Claire M. Connell, Gemma Bridge, Carin K. Ingemarsdotter, Suzanne Dowson, Atsushi Shibata, Michelle Lockley, Sarah A. Martin, and Iain A. McNeish.
    • Journal Title

      Molecular Cancer Research

      Volume: 14(1): Pages: 44-55

    • DOI

      10.1158/1541-7786

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Presentation] AnalysisofclusterandDNAdoublestrandbreakafterheavyionirradiationusinghighresolutionmicroscopy2016

    • Author(s)
      柴田淳史
    • Organizer
      14th International Workshop on Radiation Damage to DNA
    • Place of Presentation
      メルボルン(オーストラリア)
    • Year and Date
      2016-03-21 – 2016-03-22
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] DNA修復研究からの放射線治療発展へのアプローチ2016

    • Author(s)
      柴田淳史
    • Organizer
      .茨城大学理学部公開シンポジウム「第9回 Quantum Medicine 研究会」
    • Place of Presentation
      茨城大学理学部(茨城県・水戸市)
    • Year and Date
      2016-03-13
    • Invited
  • [Presentation] DNA二本鎖切断修復経路を決定する時空間的制御機構の解明2015

    • Author(s)
      柴田淳史
    • Organizer
      放射線医学総合研究所 第7回次世代放射線治療研究セミナー・放医研研究会共催「若手研究者によるDNA修復の最先端」
    • Place of Presentation
      放射線医学総合研究所(千葉県・千葉市)
    • Year and Date
      2015-12-18
    • Invited
  • [Presentation] 多様なDNA損傷応答の統合制御機構2015 ~ゲノム不安定性の病態解明研究~2015

    • Author(s)
      柴田淳史
    • Organizer
      第38回 日本分子生物学会・第88回日本生化学会 合同大会
    • Place of Presentation
      神戸ポートピアホテル 本館 B1F 偕楽1(兵庫県・神戸市)
    • Year and Date
      2015-12-03
  • [Presentation] Understanding the molecular mechanism for developing a novel treatment strategy in radiotherapy2015

    • Author(s)
      柴田淳史
    • Organizer
      日本放射線腫瘍学会第28回大会
    • Place of Presentation
      前橋商工会議所 サクラ(群馬県・前橋市)
    • Year and Date
      2015-11-19
    • Invited
  • [Presentation] BRCA1によるDNA end resectionの調節機構の解明2015

    • Author(s)
      柴田淳史
    • Organizer
      国立遺伝学研究所「染色体DNAの安定維持の分子メカニズム」
    • Place of Presentation
      国立遺伝学研究所・講堂(静岡県・三島市))
    • Year and Date
      2015-10-01
    • Invited
  • [Presentation] District regulation of DNA double strand break resection after heavy ion irradiation2015

    • Author(s)
      柴田淳史
    • Organizer
      The 2015 IMB conference, DNA Repair & Genome Stability in a Chromatin Environment
    • Place of Presentation
      マインツ(ドイツ)
    • Year and Date
      2015-06-04 – 2015-06-07
    • Int'l Joint Research
  • [Remarks] DNA修復研究 柴田研究室

    • URL

      http://shibatalab.com

  • [Remarks] SHIBATA LAB

    • URL

      http://shibatalab.com/english

  • [Remarks] 先端科学研究指導者育成ユニット

    • URL

      http://asrldu.dept.med.gunma-u.ac.jp

URL: 

Published: 2017-01-06  

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