2015 Fiscal Year Annual Research Report
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26670582
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
宮川 周士 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90273648)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ブタ内在性レトロウィルス(PERVs) / CRISPR/ＣＲシステム / OFF Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ効果 / Gag-pol |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度は、PERV遺伝子のgagおよびpolの領域においてKnockout (KO) 効率の高いターゲット配列 (gRNA) をそれぞれ1か所ずつ選定し得た。今年度は、それらの配列を用いて、実際にPERVをKOしたブタ細胞の樹立を試みた。
まず、細胞樹立のために薬剤選択マーカーneomycin耐性遺伝子を組み入れたpX330 = U6-gRNA+Cas9+neomycinの作製に取り組んだ。 Neomycin耐性遺伝子を組み入れたpX330 (既存のもの)と、選定したgRNAが組み込まれたpX330 (昨年度作製) の2つのplasmidを用意し、それらを制限酵素SacIIとXbaIで処理した。Vector側、insert側をゲル抽出によって採取し、それらをligationし、pX330 = U6-gRNA+Cas9+neomycinが完成した。
次にこのうちgag領域をターゲットとしたplasmidを制限酵素NotIでリニアライズし、PK15細胞 (ブタ腎臓細胞) にLipofection法でtransfectionした。Transfectionした細胞は、neomycinによるselection後、限界希釈によってクローニングを行った。計17個のクローンが得られた。それら全てについてPCRでneomycin配列 (約1070 bp) がゲノムにintegrateされているかどうか調べた。結果、integrateされているクローンは15個に絞られた。これらはgRNAおよびCas9も含めて安定に発現していると考えられた。さらにこれらクローンのgag-KO領域をダイレクトシークエンスした結果、1個のクローンのgag領域に変異を確認することができた。
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[Journal Article] Knockout of cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid (CMP-NeuAc) hydroxylase from porcine endothelial cells by a CRISPR system.2016
Author(s)
Rieko Sakai, Yoko Esaki, Hidetoshi Hasuwa, Masahiko Ikawa, Pei-chi Lo, Rei Matsuura, KengoNakahata, Masahiro Zenitani, Mayumi Asada, Akira Maeda, Hiroshi Eguchi, HiroomiOkuyama and Shuji Miyagawa.
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Journal Title
Transplant Proc. 2016
Volume: ( in press)
Pages: ( in press)
DOI
Peer Reviewed
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