変形性関節炎におけるエンドサイトーシスの新たな機能とその重要性

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26670665
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 廣畑 聡 岡山大学, 保健学研究科, 教授 (90332791)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山田 浩司 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (80325092) ; 大月 孝志 岡山大学, 保健学研究科, 非常勤研究員 (10534802)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 軟骨 / 培養細胞

Outline of Annual Research Achievements

『アグリカンを分解する最もメジャーなアグリカナーゼとされるADAMTS5が何故ヒトOAサンプルでは発現量が多くないのか？』という疑問にこたえるべく、本研究の目的は“ADAMTS5の制御にエンドサイトーシスが関わっており、その破綻が変形性関節炎の発症を引き起こす”という新たな仮説をもとに二つのテーマに挑戦する。
1) ADAMTS5の細胞内取り込み機構としてのエンドサイトーシスの重要性：エンドサイトーシスによりADAMTS5が制御されているメカニズムを検討
2) 変形性関節炎(OA)の病態におけるエンドサイトーシスの役割：軟骨においてエンドサイトーシス阻害/促進がもたらす効果を検討する
まず、培養軟骨様細胞をN-Hydroxysuccinimide (NHS)-SS-biotinでラベルした後に、エンドサイトーシスにて細胞内に取り込まれたビオチンを検出した。4℃と37℃の二つの条件を比較したところ、エンドサイトーシスを起こさないとされる4℃に比べて37℃では細胞内にビオチンの取り込みを確認できた。同時に、アグリカン分解産物をアグリカナーゼ切断が特定できるネオエピトープ抗体（374ARGSV: BC-3抗体)を用いてウエスタンブロット法でアグリカン分解への効果をみたところ、同細胞において培養液中に切断されたアグリカンを検出することに成功した。
さらに、エンドサイトーシス関連分子であるLRP-1およびRAPの発現について検討した。RT-PCR法にてLRP-1およびRAPのmRNA発現を確認でき、本実験において用いた軟骨様細胞がエンドサイトーシス関連分子を発現し、エンドサイトーシスを起こしていることが初めて示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本実験を行ううえでもっとも基礎となるエンドサイトーシス実験に、申請者が用いようとしている軟骨様細胞が果たして適切であるか報告がなかったため、まず最初に同細胞にエンドサイトーシスが起こるのか、およびエンドサイトーシス関連分子が発現しているのかを検証することから実験を開始した。
実績報告のごとくビオチンの取り込みを確認することに成功し、同細胞がエンドサイトーシスを起こしており、関連分子も発現していることを発見した。

Strategy for Future Research Activity

今後はタンパクレベルでエンドサイトーシス関連分子が発現しているか否かを検討するとともに、in ivivoモデルで関連分子の発現を検討する。

Causes of Carryover

予定より安く消耗品を購入できたため、未使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当初の研究計画を実施するために消耗品購入に充てる。

Research Products

• [Journal Article] Interleukin-1β induced nuclear factor-κB binds to a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motif 9 promoter in human chondrosarcoma cells. (2015)
  • Author(s): Altuntas A, Halacli SO, Cakmak O, Erden G, Akyol S, Ugurcu V, Hirohata S, Demircan K.
  • Journal Title: Mol Med Rep. Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.3892/mmr.2015.3444.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Low serum level of secreted frizzled-related protein 5, an anti-inflammatory adipokine, is associated with coronary artery disease. (2014)
  • Author(s): Miyoshi T, Doi M, Usui S, Iwamoto M, Kajiya M, Takeda K, Nosaka K, Nakayama R, Okawa K, Takagi W, Nakamura K, Hirohata S, Ito H.
  • Journal Title: Atherosclerosis Volume: 233（2） Pages: 454-459
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] ADAMTS1 inhibits lymphangiogenesis by attenuating phosphorylation of the lymphatic endothelial cell-specific VEGF receptor. (2014)
  • Author(s): Inagaki J, Takahashi K, Ogawa H, Asano K, Hatipoglu OF, Zeynel Cilek M, Obika M, Ohtsuki T, Hofmann M, Kusachi S, Ninomiya Y, Hirohata S.
  • Journal Title: Exp Cell Res. Volume: 323(2) Pages: 263-275
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] ADAMTS4 and ADAMTS5 Knockout Mice Are Protected from Versican but Not Aggrecan or Brevican Proteolysis during Spinal Cord Injury. (2014)
  • Author(s): Demircan K, Topcu V, Takigawa T, Akyol S, Yonezawa T, Ozturk G, Ugurcu V, Hasgul R, Yigitoglu MR, Akyol O, McCulloch DR, Hirohata S.
  • Journal Title: Biomed Res Int. Volume: 2014 Pages: 693746
  • DOI: 10.1155/2014/693746.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Early eicosapentaenoic acid treatment after percutaneous coronary intervention reduces acute inflammatory responses and ventricular arrhythmias in patients with acute myocardial infarction: A randomized, controlled study. (2014)
  • Author(s): Doi M, Nosaka K, Miyoshi T, Iwamoto M, Kajiya M, Okawa K, Nakayama R, Takagi W, Takeda K, Hirohata S, Ito H.
  • Journal Title: Int J Cardiol. Volume: 176(3) Pages: 577-582
  • DOI: 10.1016/j.ijcard.2014.08.055.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] HYALURONAN REDUCED EXTRACELLULAR MATRIX DEGRADATION BOTH IN VITRO AND IN VIVO. (2015)
  • Author(s): Takashi Ohtsuki, Yuri Shoji, Keiichi Asano, Aya Hirata, Teruyuki Kawadi, Junko Ingaki, Kanae Kumagishi, Keiichiro Nishida, Toshitaka Oohashi, Satoshi Hirohata.
  • Organizer: HA2015
  • Place of Presentation: イタリア フィレンツェ
  • Year and Date: 2015-06-07 – 2015-06-11
• [Presentation] Perinatal lethality in ADAMTS1 deficient mouse (2014)
  • Author(s): Satoshi Hirohata, Omer Faruk Hatipoglu, Eriko Kusunoki, Takashi Ohtsuki, Junko Inagaki, Keiichi Asano, Yuri Shoji, Teruyuki Kawadi, Aya Hirata, Yoshifumi Ninomiya
  • Organizer: American Society for Matrix Biology Biennial Meeting
  • Place of Presentation: 米国 クリーブランド
  • Year and Date: 2014-10-12 – 2014-10-15
• [Presentation] ADAMTS cleaved versican in tumor angiogenic area. (2014)
  • Author(s): Keiichi Asano, Junko Inagaki, Matthias Hofmann, Teruyuki Kawadi, Aya Hirata, Yuri Shoji, Takashi Ohtsuki, Yoshifumi Ninomiya, Satoshi Hirohata
  • Organizer: American Society for Matrix Biology Biennial Meeting
  • Place of Presentation: 米国 クリーブランド
  • Year and Date: 2014-10-12 – 2014-10-15
• [Presentation] Decreased Sox9 mRNA expression by cytokine stimulation was ameliorated by hyaluronan in chondrosarcoma cells (2014)
  • Author(s): Takashi Ohtsuki, Satoshi Hirohata, Yuri Shoji, Keiichi Asano, Aya Hirata, Teruyuki Kawadi, Junko Ingaki, Kanae Kumagishi, Keiichiro Nishida, Toshitaka Oohashi, Aiji Ohtsuka
  • Organizer: American Society for Matrix Biology Biennial Meeting
  • Place of Presentation: 米国 クリーブランド
  • Year and Date: 2014-10-12 – 2014-10-15
• [Presentation] 変形性膝関節症の治療効果に関する生化学的解析 (2014)
  • Author(s): 熊岸加苗、大月孝志、廣畑聡、河村顕治、大塚愛二、坂田賢一郎、坂田俊輔
  • Organizer: 第27回日本臨床整形外科学会学術集会
  • Place of Presentation: 仙台市
  • Year and Date: 2014-07-20 – 2014-07-21
• [Presentation] 胎生期ADAMTS1ノックアウトマウスの解析 (2014)
  • Author(s): 楠絵里子、稲垣純子、大月孝志、川地輝幸、平田彩、浅野恵一、マティアス ホフマン、二宮善文、廣畑 聡
  • Organizer: 第46回日本結合組織学会学術大会 第61回マトリックス研究会大会
  • Place of Presentation: 名古屋市
  • Year and Date: 2014-06-05 – 2014-06-07
• [Presentation] 担がんマウスモデルにおけるバーシカン分解の解析 (2014)
  • Author(s): 浅野恵一、稲垣純子、マティアス ホフマン、川地輝幸、平田彩、大月孝志、二宮善文、廣畑 聡
  • Organizer: 第46回日本結合組織学会学術大会 第61回マトリックス研究会大会
  • Place of Presentation: 名古屋市
  • Year and Date: 2014-06-05 – 2014-06-07
• [Presentation] ヒアルロン酸短期投与によるラット変形性関節症モデルの関節軟骨保護効果の検討 (2014)
  • Author(s): 大月孝志、廣畑聡 、障子友理、浅野恵一 、平田彩 、川地輝幸、稲垣純子、熊岸加苗、西田圭一郎、二宮善文
  • Organizer: 第46回日本結合組織学会学術大会 第61回マトリックス研究会大会
  • Place of Presentation: 名古屋市
  • Year and Date: 2014-06-05 – 2014-06-07
• [Presentation] ADAMTS1はVEGFCと結合してリンパ管新生を抑制する (2014)
  • Author(s): 稲垣純子、高橋克之、小川弘子、浅野恵一、Omer Faruk Hatipoglu、 Mehmet Zeynel Cilek、小比賀真就、大月孝志、 Matthias Hofmann、 草地省蔵、二宮善文、廣畑聡
  • Organizer: 第46回日本結合組織学会学術大会 第61回マトリックス研究会大会
  • Place of Presentation: 名古屋市
  • Year and Date: 2014-06-05 – 2014-06-07
• [Presentation] 新規X線造影剤による変形性膝関節症ラット関節軟骨の高解像度マイクロＣＴ造影 (2014)
  • Author(s): 大橋俊孝、加来田博貴、芳谷 学、大月孝志、大野充昭、山田翔也、前原亜美、廣畑 聡、西田圭一郎、窪木拓男、二宮善文
  • Organizer: 第46回日本結合組織学会学術大会 第61回マトリックス研究会大会
  • Place of Presentation: 名古屋市
  • Year and Date: 2014-06-05 – 2014-06-07
• [Presentation] Cyclic tensile strain (CTS) down-regulates interleukin(IL)-1β and Tumor necrosis factor(TNF)-α induced matrix degrading enzymes mRNA expression in human chondrosarcoma cell line OUMS-27 by mechano sensor. (2014)
  • Author(s): Ohtsuki1 T, Kawadi T, Hirata A, Asano K, Inagaki J, Kumagishi K, Nishida K, Ninomiya Y, Hirohata S
  • Organizer: International symposium on mechanobiology 2014
  • Place of Presentation: 岡山市
  • Year and Date: 2014-05-20 – 2014-05-23
• [Presentation] Creation of Novel Articular Cartilage Specific X-ray Imaging Probes Composed of Lysine Oligomers. (2014)
  • Author(s): Oohashi T, Hagaya M, Ono M, Yamada S, Ohtsuki T, Maehara A, Hirohata S, Nishida K, Kuboki T, Kakuta H, NinomiyaY.
  • Organizer: International symposium on mechanobiology 2014
  • Place of Presentation: 岡山市
  • Year and Date: 2014-05-20 – 2014-05-23
• [Presentation] ADAMTS1 inhibits lymphangiogenesis by attenuating phosphorylation of the lymphatic endothelial cell-specific VEGF receptor. (2014)
  • Author(s): Junko Inagaki, Katsuyuki Takahashi, Hiroko Ogawa, Omer Hatipoglu, Mehmet Cilek, Masanari Obika, Takashi Ohtsuki, Shozo Kusachi, Yoshifumi Ninomiya, Satoshi Hirohata
  • Organizer: The 18th International Vascular Biology Meeting
  • Place of Presentation: 京都市
  • Year and Date: 2014-04-14 – 2014-04-17