2014 Fiscal Year Research-status Report
骨特異的プロモーター+レポーター遺伝子導入ＥＳ細胞を用いた骨再生の新たな試み
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26670669
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
大田 智美 宮崎大学, 医学部, 医員 (80644096)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
帖佐 悦男 宮崎大学, 医学部, 教授 (00236837)
関本 朝久 宮崎大学, 医学部, 講師 (60305000)
荒木 正健 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 准教授 (80271609)
荒木 喜美 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 教授 (90211705)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ES細胞 / 骨特異的プロモーター / トランスジーン / 骨分化特異的培養 / 骨再生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
整形外科領域における骨折などの観血的治療の際に、骨粗鬆症などによる高度骨欠損に対して大量の骨移植を必要とする場面を臨床現場では数多く経験するが、現在でも人工骨や同種骨移植に頼らざるを得ないのが現状で、十分な自家移植骨を得ることは困難である。これまでの骨再生研究においては骨髄間葉系細胞を用いた多数の骨分化誘導の報告があるが(Yu-Shik.H, 2007, Mahmood A, 2011)、その量や分化効率、増殖能は限られており、未だ臨床治療に十分なレベルには達していない。一方で、ES細胞の持つ高い自己複製能と旺盛な増殖能は、組織再生の面で非常に大きな利点であると言える。これまで移植医療には、拒絶反応、感染、倫理的問題があったが、2006年のiPS細胞の登場でこれらの問題が一挙に解決できるようになり、今後骨再生においても、ES細胞の効率的かつ安全な分化増殖制御法の確立は極めて重要と考える。
現在、マウスES細胞を効率的に骨組織へ分化させるプロトコールを標準化している(Jaiswal N, 1997, Schuldiner M, 2000, Phillips BW, 2001, Kawaguchi J, 2005)。本研究は、骨組織に特異的に発現するプロモーターにレポーター遺伝子を接続したトランスジーンを作製し、そのトランスジーンをエレクトロポレーション法でマウスES細胞に導入して、骨専用培地で特異的かつ効率的にES細胞を骨組織へ分化誘導させることを目的としている。現時点で4種類のトランスジーンの制限酵素地図は完成しており、現在構築中である。今後これらのトランスジーンを完成させ、ES細胞に導入し、それぞれのES細胞を培養しながら骨分化増殖能を評価する。本研究の最終的な目標は、テーラーメイド医療として、骨をin vitroで形成し骨再生医療に応用できる基盤を作製することである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在、骨組織に特異的に発現するプロモーターにレポーター遺伝子を接続したトランスジーンを4種類構築中である。トランスジーンに用いる骨組織特異的プロモーターとして、Collagen I (Rossert J, 1995)、Osteocalcin (Kesterson RA, 1993)、Runx2 (Xiao ZS, 2001)、Osterix (Lu X, 2006) プロモーターを用いる計画である。Collagen I 及びOsteocalcinにおいては、骨芽細胞や歯芽細胞に特異的に発現させるための領域が同定されており、特定の遺伝子を骨芽細胞や歯芽細胞内で特異的に発現させる目的で利用が試みられている。レポーター遺伝子としては、β-galactosidaseとネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子であるβ-geoとAcGFP1など蛍光タンパク遺伝子の2種類をIRESで接続している。
同時に、マウスES細胞を効率的に骨組織へ分化させるプロトコールを標準化している。まずKTPU8マウスES細胞を0.15％ゼラチンコートディッシュに播種する(培地組成：DMEM；SIGMAD5648, NaHCO3, 2ME, ピルビン酸ナトリウム)。均一な胚様体(EB)形成の為にMPCポリマーコートディッシュを用いる(96well法1000個/200μl)。EB 3日目より5日目まで3日間レチノイン酸0.1μMを添加。5日目より0.1%ゼラチンコートDishにてアスコルビン酸50μg/ml, β-グリセロリン酸10mM添加（2日に1回培地交換)。10日目からデキサメタゾン0.1µMを21日目まで添加。以上を骨分化誘導標準プロトコールとして確立した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き来年度も、マウスES細胞を効率的に骨組織へ分化させる標準プロトコールの検討を重ね、上記トランスジーンを完成させる予定である。そのトランスジーンをエレクトロポレーション法によりマウスES細胞に導入し、ネオマイシン耐性コロニーを単離する。続いて、単離されたクローンをネオマイシン存在下で骨分化増殖特異的培地を用いて培養を行い骨分化増殖能を評価する。培地については、分化と成熟の段階でそれぞれ変更する予定である。これまでのES細胞から骨芽細胞へ分化させた報告によると、まずES細胞を分化抑制因子のない培地で培養し、胚様体を形成させた後、骨特異的培地を用いて培養する（Schuldiner M, 2000, Kawaguchi J, 2005）。したがって、ネオマイシンを効かせる時期はいろいろ検討が必要と考える。骨分化特異的培地にはレチノイン酸、アスコルビン酸、β-グリセロリン酸、デキサメタゾンを添加する(Jaiswal N, 1997, Phillips BW, 2001)。そして未分化な状態、および浮遊培養し胚様体から骨へ分化していく過程を経時的にX-gal染色し、どの時点でどこが染色されるか観察する。同時に蛍光にてもチェックする。このように随時、β-geo、蛍光タンパクの発現パターンをモニターし、さらに骨特異的分化をHEおよび骨特異的染色 (アリザリンレッド染色、ALP染色など)、免疫染色、In situ hybridization、X-gal染色などにて評価する。本研究で得られた成果については、学会、論文などで発表する予定である。
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