2015 Fiscal Year Research-status Report
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26670675
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
入江 敦 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 主任研究員 (10280786)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 破骨細胞 / リン脂質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、破骨細胞分化における膜脂質動態に焦点を当て、脂質研究の視点から破骨細胞分化過程における破骨細胞の融合・多核化のメカニズムを解明することを目的としている。破骨細胞分化過程において、リン脂質の一種であるホスファチジルエタノールアミン（PE）が細胞膜二重層内層から外層へ移行し、このことにより膜曲率が変化して破骨細胞融合が促進されることを既に見出しており、PEの移行にリン脂質輸送トランスポーター・ABCB4とABCG1が関与することを明らかにしてきた。
本年度、PEの動態に関わる分子の探索をさらに進め、ABCトランスポーターだけではなく、リン脂質生合成酵素の一種と想定されている機能未知タンパク質・LPEAT2について次の知見を得た。まず、破骨細胞分化融合過程においてLPEAT2の発現が上昇していることが明らかとなった。さらに、LPEAT2の発現ノックダウンにより細胞膜外層のPEが減少し、破骨細胞形成が抑制された。このことから、今までに明らかにしたABCB4とABCG1によるPEの局在変化のみならず、LPEAT2が、破骨細胞形成に重要な役割を持つことを示唆しており、今後さらにLPEAT2の生理機能などに関して解析を進める予定である。
さらに申請者は関節炎との関連が予想される脂質代謝酵素の一種のsPLA2-XIIAについて、基質特異性を解析した。その結果、sPLA2-XIIAは、特に好んでPEを基質として、DHAをはじめとした高度不飽和脂肪酸を反応産物とすることが明らかとなった。このことから、高度不飽和脂肪酸、またはその代謝産物が関節炎発症に関与することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初26年度に予定していたsPLA2-XIIAの標的リン脂質とその代謝産物の同定は、本年度、評価系を確立し、さらに代謝産物を同定できたので、昨年度までの進捗状況の遅れを取り戻した。また、26年度と27年度にまたがって予定していたPE-DHA生合成経路に関わる分子の網羅的探索作業を完了し、新たにLPEAT2が破骨細胞形成に関与することを明らかにした。これにより、26年度までの段階ではABCB4とABCG1によるPEの局在変化が破骨細胞形成に関わることが明らかとなっていたのが、本年度の研究により、ABCトランスポーターに加えてLPEAT2が協調して破骨細胞融合過程におけるPEの動態を制御する可能性が見出された。このように本年度までの研究により、研究目的であるPE動態の責任分子の全貌の解明に向けて、大きな前進となった。
さらに、sPLA2-XIIA欠損マウスについて関節炎モデルを用いた解析は、当初27年度以降に予定していた研究であったが、これについては、26年度に前倒しして遂行しており、ほぼ、申請時の予定通りに進捗している。
以上のような理由により、現在までの達成度としては、当初計画とは遂行する順序が異なっているものの、概ね当初の計画どおりに進展していると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
長年、LPEAT2はPE生合成酵素と考えられてきたが、PEの生合成への関与を生化学的実験により解析した研究は殆どない。そこで、破骨細胞分化過程においてLPEAT2をノックダウンした細胞におけるリン脂質組成を、質量分析を用いたリン脂質分子種のプロファイリングにより決定する。これにより、LPEAT2によるPE動態が破骨細胞形成に必須であることを明らかにするとともに、機能が未知であったLPEAT2の生理的意義を明らかにする。
続いて、本年度明らかにしたsPLA2-XIIAの標的リン脂質とその代謝産物の解析の比較対象として、sPLA2ファミリーのsPLA2-IIIの基質特異性を明らかにし、XIIAの酵素特性をより明確なものとする。手法としては、マウス組織より抽出した脂質を基質とし、リコンビナントsPLA2タンパク質を用いて質量分析プロファイリングにより代謝産物を解析する。
さらに、sPLA2-XIIA欠損マウスにおいて、コラーゲン抗体誘導関節炎モデルあるいはコラーゲン誘導関節炎モデルを施行し、足の腫脹や炎症マーカー発現などの関節炎病態をスコアリングするとともに、炎症部位の骨組織形態を精査し、さらに血清中の骨代謝マーカーを解析する。そして、この病態モデルにおけるTh17応答や、破骨細胞の機能に関わるシグナルと、上述した解析で明らかにしたsPLA2-XIIAの代謝産物との関連を調べることにより、sPLA2-XIIAの関節炎や関節炎炎症部位における破骨細胞の機能に対する役割を解明する。
以上のような方策で、脂質関連分子の破骨細胞や骨疾患における役割を明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
当初27年度に予定していたsPLA2-XIIAの関節炎モデルマウスを用いた解析を前年度に前倒しして行っていたために、当初予定していた関連試薬類の購入費用が少なかった。その代わりに本年度施行したPEの動態に関わる分子の探索実験は、消耗品の購入額が少なく、結果として本年度計上していた消耗品購入額が計上額を下回った。
旅費に関しては、学会発表が、一カ所が近接地で支出額が少なく、またもう一カ所は科研費以外の研究費から支出したために、当初予定していた国内旅費の支出が殆どなかった。
人件費・謝金に関しては、投稿論文の校正代を支出費目「その他」で支出したために、謝金としての支払いが発生しなかった。さらに、投稿した論文が掲載に至らなかったために、別刷り代金が発生しなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
来年度は、LPEAT2をノックダウンした細胞における脂質分析を行うので、関連試薬の購入を予定している。また、関節炎病態モデルマウスの解析に、リアルタイムPCRといった分子生物学的な試薬、また組織染色や細胞免疫染色用に抗体の購入予定である。さらに、病態モデルマウスや遺伝子改変マウスから初代培養細胞を単離し、培養するための培養関連試薬、培養細胞を用いた細胞生物学的な解析のための試薬を購入する。以上の消耗品試薬類は比較的高額なものが多いために、本年度繰り越しとなった金額と来年度計上額との合計金額分の消耗品試薬類の支出が見込まれる。
さらに論文投稿を予定しており、別刷り代をはじめとした投稿に際した費用の支出が見込まれる。また、遠隔地での学会参加が予定されており、計上額の支出が見込まれる。
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