末梢循環中セルフリーの核酸解析による泌尿器癌薬物療法抵抗因子の同定

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26670695
• Research Institution: Akita University
• Principal Investigator: 羽渕 友則 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00293861)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 黄 明国 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60448503) ; 南條 博 秋田大学, 医学部, 准教授 (70250892) ; 大山 力 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80282135)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: エクソソーム / miRNA / 腎細胞癌 / 分子標的薬 / バイオマーカー / 泌尿器癌 / Liquid Biopsy

Outline of Annual Research Achievements

●転移を有する腎癌、尿路上皮癌、前立腺癌患者で、治療前、治療中の画像診断による効果判定時に血清・血漿を採取。各サンプルよりタンパク、エキソソームmiRNAを得る。患者が明らかなPDや治療耐性で超進展状態になったmiRNAや各種サイトカインを解析。ドミナントなmiRNA異常発現を絞る。このドミナントな異常を過去の経時サンプルでのfractionを評価。治療抵抗性へのキーとなる異常を同定することを目的とした。
●転移を有する腎癌、尿路上皮癌、前立腺癌患者で、治療前、治療中の画像診断による効果判定時に血清・血漿を採取。各サンプルよりタンパク、エキソソームmiRNAを得る。患者が明らかなPDや治療耐性で超進展状態になったmiRNAや各種サイトカインを解析。ドミナントなmiRNA異常発現を絞る。このドミナントな異常を過去の経時サンプルでのfractionを評価。治療抵抗性へのキーとなる異常を同定することを目的とした。
●転移性進行腎癌の代表的治療薬であるアキシチニブ（AXT）で治療した進行腎癌患者血清中のmiRNAや血清蛋白の発現と予後の関連を解析し、AXT治療効果を予測する血清因子を探索した。対象は当院でAXTを投与した進行腎癌16例。AXT投与前後の血清miR-21、miR-155、miR-210、miR-378の発現を定量PCRで解析した。また、AXT投与前後の血清中の16種類の蛋白発現をBio-Plex Pro; Human Cancer Biomarker Panelで解析した。
●結果として、AXT投与後miR-21低下群は有意に無増悪生存期間が延長した（p = 0.032）。AXT投与前HGF、sIL-6R、PECAM-1高値群で有意に無増悪生存期間が延長した（p = 0.043, p = 0.033, p = 0.002) 。以上より、AXT治療前後の血清miR-21変化や、AXT投与前の血清PECAM-1、sIL-6R、HGFが治療効果を予測するバイオマーカーとなりうると考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

●液性生検（Liquid Biopsy）の実地臨床応用にむけて、患者末梢血からのエクソソーム抽出⇒エクソソーム由来のmiRNA抽出に成功し、さらには代表的miRNAの定量化解析にも成功、アッセイを確立できた。また、同時に血清サイトカインもパネルで解析し、治療効果を反映するマーカー候補も同定できた。今後はエクソソーム由来のmiRNAの定量結果とサイトカインの関係、治療効果や予後との関連性を解析し、転移性腎癌に対する分子標的薬（血管新生阻害薬）をモデルに液性生検（Liquid Biopsy）の確立を目指す。
●27年度は転移性進行腎癌の代表的治療薬であるアキシチニブ（AXT）で治療した進行腎癌患者血清中のmiRNAや血清蛋白の発現と予後の関連を解析し、AXT治療効果を予測する血清因子を探索した。対象は当院でAXTを投与した進行腎癌16例。AXT投与前後の血清miR-21、miR-155、miR-210、miR-378の発現を定量PCRで解析した。また、AXT投与前後の血清中の16種類の蛋白発現をBio-Plex Pro; Human Cancer Biomarker Panelで解析した。
●結果として、AXT投与後miR-21低下群は有意に無増悪生存期間が延長した（p = 0.032）。AXT投与前HGF、sIL-6R、PECAM-1高値群で有意に無増悪生存期間が延長した（p = 0.043, p = 0.033, p = 0.002) 。以上より、AXT治療前後の血清miR-21変化や、AXT投与前の血清PECAM-1、sIL-6R、HGFが治療効果を予測するバイオマーカーとなりうると考えられた。
●以上、おおむね、研究計画提出時の計画や目標にむけて進行していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

●平成26年、27年度に進めた研究を継続し、さらに多くの検体やさらに多くのポイント（治療経過におけるイベントが発生した時点）での検体収集を行う。
●そのうえで、エキソソーム由来miRNAの解析を、先ず各患者で薬物療法によって、 (ⅰ)効果を示し最も病変が少なくなった時点の血漿サンプルと、 (ⅱ)抵抗性となり明らかな病変が多発化・進行した時点での血漿サンプルにおいて、miRNA Array解析（miRCURY LNA microRNA Array）を用いて、3000を超えるmiRNA種を一挙にスクリーニングする。この (ⅰ)と(ⅱ) のmiRNAの発現量プロフィールを比較し、著しい違いを示した、miRNAを治療抵抗性関連候補として、解析する。
●また、血清サイトカインをパネルBio-Plex Pro; Human Cancer Biomarker Panelを用いて評価し、miRNAのデータや臨床データとの相関の有無を検討する。
●さらには候補遺伝子については、トランスフェクションクション、ノックダウン、免疫染色、プロモーター解析、その上での、細胞における過剰発現、過少発現時の浸潤能、増殖能、転移能、抗アポトーシス作用などへの影響を評価し、分子マーカーや分子標的となるかを検討する

Research Products

• [Journal Article] Diet-induced alteration of fatty acid synthase in prostate cancer progression (2016)
  • Author(s): Huang M, Koizumi A, Narita S, Inoue T, Tsuchiya N, Nakanishi H, Numakura K, Tsuruta H, Saito M, Satoh S, Nanjo H, Sasaki T, Habuchi T
  • Journal Title: Oncogenesis Volume: ５ Pages: e195
  • DOI: 10.1038/oncsis.2015.42
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] INPP4B is a PtdIns(3,4,5)P3 phosphatase that can act as a tumor suppressor (2015)
  • Author(s): Kofuji S, Kimura H, Nakanishi H, Nanjo H, Takasuga S, Liu H, Eguchi S, Nakamura R, Itoh R, Ueno N, Asanuma K, Huang M, Koizumi A, Habuchi T, Yamazaki M, Suzuki A, Sasaki J, Sasaki T
  • Journal Title: Cancer Discov Volume: ５ Pages: 730-739
  • DOI: 10.1158/2159-8290.CD-14-1329
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Risk Analysis of Prostate Cancer in PRACTICAL, a Multinational Consortium, Using 25 Known Prostate Cancer Susceptibility Loci (2015)
  • Author(s): Amin Al Olama A, Ingles SA, Habuchi T, et al. Kote-Jarai Z, Eeles RA, Easton DF
  • Journal Title: Cancer Epidemiol Biomarkers Prev Volume: 24 Pages: 1121-1129
  • DOI: 10.1158/1055-9965.EPI-14-0317
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Lymphovascular invasion is significantly associated with biochemical relapse after radical prostatectomy even in patients with pT2N0 negative resection margin (2015)
  • Author(s): 15)Mitsuzuka K, Narita S, Koie T, Kaiho Y, Tsuchiya N, Yoneyama T, Kakoi N, Kawamura S, Tochigi T, Ohyama C, Habuchi T, Arai Y
  • Journal Title: Prostate Cancer Prostatic Dis Volume: 18 Pages: 25-30
  • DOI: 10.1038/pcan.2014.40
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Exosomal miRNAs and serum cytokines as predictors for treatment outcomes in patients with metastatic renal cell carcinoma treated with axitinib (2016)
  • Author(s): Naoko Suzuki-Honma*, Akita, Japan, Norihiko Tsuchiya, Yamagata, Japan, Takamitsu Inoue, Shintaro Narita, Mitsuru Saito, Hiroshi Tsuruta, Atsushi Maeno, Shigeru Satoh, Tomonori Habuchi
  • Organizer: Annual Meeting of America Urological Association
  • Place of Presentation: San Diego, CA, USA
  • Year and Date: 2016-05-06 – 2016-05-10
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 秋田大学大学院医学系研究科 腎泌尿器科学
  • URL: http://www.med.akita-u.ac.jp/~hinyoki/