2014 Fiscal Year Research-status Report
ライブラリースクリーニングを用いたCRPCに対する新規創薬標的分子の探索
| Project/Area Number |
26670700
|
|---|
| Research Institution | Kyoto University |
|---|
Principal Investigator |
中村 英二郎 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90293878)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
室伏 善照 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (50448578)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | CRPC / Prostate cancer / Androgen |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
shRNA library screening (１次スクリーニング)
Cellecta社のPooled Lentiviral shRNA Libraries（http://www.cellecta.com/）をLibrary sourceとしてLentiviral Packaging plasmid を用いて Virus supernatantを作製し１細胞に対して1個のFragmentがIntegrationされる様にmultiplicity of infection（MOI）を調整した上でLNCaP細胞に感染させた。Infectionを行ったLNCaP細胞をPuromycinでselectionを行った後にCSFBS下での培養を行ったところ複数個のクローンが育っている(１次スクリーニング) 。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記の結果より、アンドロゲン非存在下で増殖している細胞はIntegrateされたshRNAにより去勢抵抗性を獲得したクローンであることが期待される。複数個のクローンが得られていることから、shRNA library screeningにおける１次スクリーニングが順調に経過していると考える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
shRNAの発現によりアンドロゲン非依存性増殖能を獲得した上記のクローンをpick upし、in vitroにおいて増殖を行う。その後にgenomic DNAを抽出、IntegrateされたshRNA配列をPCR法により回収した後にIn-Fusion法にてlibraryのbackbone plasmidに再導入する。回収されたplasmidをLNCaP細胞に再度Infectionを行い、CSFBS下での細胞増殖能の再現性の確認を行う。２次スクリーニングを行った細胞の中で、アンドロゲン非依存性増殖能を示した細胞よりshRNA fragmentを回収、sequencingを行いblast searchにより標的mRNAの同定を行う。
shRNA library screeningで抽出された遺伝子に関してはGene Expression Omnibus (GEO) に寄託されたPrimary CaPとCRPCでの発現を比較し、後者での発現亢進を確認する。c-DNA library screeningから得られた分子に関しては遺伝子変異の有無を確認し、認められた場合はCOSMIC (Catalogue of Somatic Mutation in Cancer) にてCRPC組織での同様の変異が報告されているか確認を行う。変異が認められない場合は、GEOでのCRPC組織における発現亢進を確認する。
|
Research Products
(1 results)
