患児の自己臍帯血由来細胞を用いた唇顎口蓋裂児の顎裂再建治療の基礎研究

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26670779
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 赤松 正 東海大学, 医学部, 准教授 (10276850)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 出生前診断 / 唇顎口蓋裂 / 臍帯血 / 骨芽細胞 / 骨再生 / 間葉型幹細胞 / 免疫不全ラット / 細胞移植

Outline of Annual Research Achievements

臍帯血由来間葉系幹細胞を分離培養しin-vitroで骨芽細胞に分化させる実験について。DMEM+10% FBSで14日間培養した後、Stem Pro osteogenesis differentiation kit (Invitrogen)で20日間培養し、評価を行った。MSC表面抗原Positive: CD29, CD44, CD90, CD105、Negative: CD14, CD45での確認、骨芽関連遺伝子発現(PCR)、骨芽関連タンパク発現(ALP, TRACP酵素活性) のいずれも確認できなかった。臍帯血由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞の誘導と樹立に関する報告は複数あるが、1個体の臍帯血に含まれる間葉系幹細胞は107～108個含まれる単核球細胞のうち1～10個程度と考えられている (0.01～0.001%以下)。臍帯血中大部分を占めるマクロファージを除去しない限りvitroでの培養は困難であると思われた。今後細胞を取り除く方法はCD45陽性細胞であるマクロファージをRosette Sep法を用いて分離する方法を試みる予定である。SCIDマウスの頭蓋骨の骨欠損に臍帯血細胞を移植し、in vivoでの骨再生を確認する実験について。
マウスの頭蓋骨に直径3mmの骨欠損を作る実験では移植容積の維持が困難である事が実験により判明した。動物種を重症免疫不全ラット（F344/NJcl-rnu系）に動物種を変更し、移植腔も直径5mm、厚さ1mmの頭蓋骨欠損に変更したが、この骨欠損はラットの骨細胞により完全に修復されてしまう事が分かった。更に移植条件を変更し、ラットの頭蓋骨骨膜下に気腔率60％のβ-TCPブロックで作製した移植腔（内径5mm厚さ1mm）とすることで、骨芽細胞が良好に増殖する移植条件を得た。現在も臍帯血由来単核細胞群移植によるin-vivoでの実験を継続中である。