2016 Fiscal Year Research-status Report
単一ドメイン抗体によるグラム陰性菌Ⅲ型病原毒性の抑制探索
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26670791
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
佐和 貞治 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10206013)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
天谷 文昌 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (60347466)
中嶋 康文 関西医科大学, 医学部, 教授 (70326239)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 緑膿菌 / PcrV / 単鎖抗体 / 肺炎 / Ⅲ型分泌システム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ラマの単一鎖抗体の抗体遺伝子情報をもとに、マウス抗PcrVモノクローナル抗体mAb166のハイブリドーマよりクローニングしたH鎖遺伝子のVHドメイン遺伝子領域を改良し、polymerase chain reactionにて増幅し、大腸菌分泌型タンパク発現ベクターであるpBAD/gⅢ(Life Technologies社のAraCプロモータ及びバクテリオファージfd gene Ⅲ proteinのリーダーペプチド下流のクローニングサイトにはめ込む単鎖抗体を発現するベクターを開発した。大腸菌株LMG194を形質転換させ、L-アラビノースで発現誘導して分泌型タンパクとして大腸菌のperiplasmに分泌集積させて浸透圧ショックにて溶出させて、C末端側ヘキサヒスチジンタグを利用して、IMACカラムにてアフィニティー精製した。精製したsd-anti-PcrV抗体について、肺上皮培養細胞に対する細胞傷害試験とマウス肺感染モデルにて、緑膿菌Ⅲ型分泌毒性への抑制効果を他の抗体との比較評価を行ってきた。この単鎖抗体は、免疫リポソームとの組み合わせにより、抗菌薬の新たなドラッグデリバリーシステムとして用いることができる。そこで、精製した単鎖抗体をリポソーム表面にポリエチレングリコール基を通じて結合させることで、免疫リポソームとして用いることで、吸入療法等に応用できる可能性が見出された。今後は、リポソーム内にコリスチン等の抗菌薬を含有させて、リポソーム表面には作成した単鎖抗体を引っ付けた新たな抗菌薬の開発につなげてゆきたい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初ラマの抗体ライブラリーからの遺伝子クローニングを考えていたが、マウス由来のブロッキング抗体遺伝子を単鎖抗体に改良したものを、さらにラマの抗体構造をもとに改良することで、同等のものが作成できることがわかったため、マウス抗体遺伝子の改編に努めてきた。遺伝子組換え抗体タンパクを可溶化することに手間取り、当初の予定より少し時間がかかっている。しかしながら、精製方法の改良により、少しづつ当初の計画に沿ったものとなってきている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在は、この単鎖抗体の遺伝子配列を遺伝子工学的にヒト抗体遺伝子配列に改変することでヒト化し、この抗体が臨床応用に用いることができるように改良を行っている。今後、このヒト化単鎖抗体の効力を様々な緑膿菌感染症モデルで評価していくことを検討している。ヒト化できれば、ヒトへの臨床応用の可能性が広がり、より有用性の高い抗体医薬品の開発につながるモデルプロジェクトに発展できると考える。
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| Causes of Carryover |
タンパクの可溶化に時間がかかり、計画に遅れが生じたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
予定通り、単鎖抗体の緑膿菌の３型分泌毒性への阻害作用について、細胞、動物モデルでの評価を行う。
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