Fkbp5ノックアウトマウスを用いた廃用性およびステロイド性骨粗鬆症の病態解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26670811
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 小守 壽文 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (00252677)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 骨細胞 / Fkbp5 / 非荷重 / グルココルチコイド

Outline of Annual Research Achievements

骨細胞ネットワークが破綻した骨芽細胞特異的Bcl2トランスジェニックマウスを用いて、骨細胞ネットワークの機能を解明してきた。このマウスを用い、非荷重時に骨細胞ネットワークの存在下でのみ誘導されるFkbp5(FK506 binding protein 5)を同定した。Fkbp5は、ステロイドレセプターに結合するシャペロン分子の１つである。Fkbp5の骨における機能を明らかにするため、ノックアウト(Fkbp5-/-)マウスを作製した。
１．グルココルチコイドレセプター(GR)、プロゲステロンレセプター(PR)、アンドロゲンレセプター(AR)、エストロゲンレセプター(ER)の転写活性化能に対するFkbp5の機能解析
GR, PR, AR, ERa, ERbそれぞれに対するレポーターベクター、標準化用のレニラルシフェラーゼベクターを、野生型マウスおよびFkbp5-/-マウスから得た頭蓋冠由来骨芽細胞にそれぞれ導入、デキサメサゾン、プロメゲストン、ジヒドロテストステロン、b-エストラジオールを種々の濃度で添加、48時間培養後にルシフェラーゼ活性を測定した。GRに対するレポーターベクターを用いたデキサメサゾンの添加実験のみ、Fkbp5-/-骨芽細胞で野生型骨芽細胞に対してレポーターアッセイの上昇を見た。
２．非荷重実験
８週齢の雄および雌の野生型マウスとFkbp5-/-マウスを用いて１週間尾部懸垂を行い、マイクロＣＴで骨密度および骨量を比較した。雄マウスでは、Fkbp5-/-マウスでのみ、骨密度低下および骨量が低下していた。雌マウスでは野生型マウスおよびFkbp5-/-マウスともに骨密度低下および骨量が低下していたが、その程度はFkbp5-/-マウスの方が強かった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

グルココルチコイドレセプター(GR)、プロゲステロンレセプター(PR)、アンドロゲンレセプター(AR)、エストロゲンレセプター(ER)の転写活性化能に対するFkbp5の機能解析は修了し、Fkbp5-/-骨芽細胞では、グルココルチコイドにのみ過剰に反応することを明らかに出来た。尾部懸垂を用いた非荷重実験も修了し、Fkbp5-/-マウスでは、雄、雌ともに非荷重時における骨量減少が野生型マウスより強く起こることを明らかに出来た。また、骨芽細胞分画および骨細胞分画を用いた遺伝子発現解析も修了している。ただし、Fkbp5-/-マウスを2.3 kb Col1a1 GFPトランスジェニックマウスと交配して、外骨膜側と内骨膜側の骨芽細胞を、セルソーターを用いてGFPで分離する方法は、予備実験に時間がかかり、まだ確立できていない。

Strategy for Future Research Activity

１．セルソーターを用いたGFP陽性骨芽細胞の分離は、週齢、尾部懸垂日数の検討等を行い、I型コラーゲンの低下が起こるが、GFPを陽性として分離できる条件検討を行う。
２．グルココルチコイド投与実験を行う。８週齢の野生型マウスおよびFkbp5-/-マウスの背部皮下に、徐放性プレドニゾロンペレット（低容量1.25m/kg/day、高容量3.2 mg/kg/day）あるいはプラセーボペレットを植え込み、１週間ごとに体重を測定するとともにマウスの挙動を観察する。４週間後に屠殺、大腿骨をマイクロCT、骨組織形態計測で比較する。TUNEL染色で、骨芽細胞、骨細胞におけるアポトーシスを比較する。屠殺時に血清を採取し、血糖、コレステロール、中性脂肪、アルブミン、コリンエステラーゼ、CPK、LDH等を測定し、プレドニゾロンの耐糖能、脂質代謝、筋に対する作用を調べる。筋重量を測定するとともに組織切片で筋細胞面積を計測し、筋萎縮を比較する。また、消化管潰瘍や出血がないか腸管を調べる。骨芽細胞分画および骨細胞分画を用いて、リアルタイムRT-PCRおよびマイクロアレイ解析を行う。マイクロアレイ解析で選択された遺伝子は、リアルタイムRT-PCRで確認後、発現ベクターを作製する。初期培養骨芽細胞に導入、アルカリホスファターゼ染色、von Kossa染色を行うとともに、骨芽細胞マーカーの発現をリアルタイムRT-PCRで調べ、骨芽細胞分化・機能に関与するか調べる。また、発現ベクターを導入した初期培養骨芽細胞を骨髄細胞と共培養、破骨細胞形成支持能を調べる。
３．１で確立した方法を用いて、尾部懸垂実験およびグルココルチコイド投与実験マウスより、外骨膜側骨芽細胞分画、内骨膜側骨芽細胞分画、骨細胞分画RNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行う。

Causes of Carryover

Fkbp5-/-マウスを2.3 kb Col1a1 GFPトランスジェニックマウスと交配して、外骨膜側と内骨膜側の骨芽細胞を、セルソーターを用いてGFPで分離する方法を検討するのに時間がかかった。そのため、2.3 kb Col1a1 GFPトランスジェニックマウスとFkbp5-/-GFPトランスジェニックマウスからGFP陽性細胞を外骨膜側と内骨膜側それぞれより単離して、マイクロアレイ解析（外注）を行うことが出来なかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

プレドニゾロンペレット（680千円）、Real Time PCR関連試薬、牛胎児血清、培養液の購入、マイクロアレイの外注（200千円／1ペアｘ6ペア＝1,200千円）、マウス維持費： 15千円/月x 12ヶ月＝180千円、国内旅費　@50千円ｘ2人=100千円に使用する。

Research Products

• [Journal Article] Novel Hedgehog Agonists Promote Osteoblast Differentiation in Mesenchymal Stem Cells. (2015)
  • Author(s): Nakamura T, Naruse M, Chiba Y, Komori T, Sasaki K, Iwamoto M, Fukumoto S.
  • Journal Title: Journal of cellular physiology Volume: 230 Pages: 922-929
  • DOI: doi: 10.1002/jcp.24823.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Cbfb regulates bone development by stabilizing Runx family proteins. (2015)
  • Author(s): Qin X, Jiang Q, Matsuo Y, Kawane T, Komori H, Moriishi T, Taniuchi I, Ito K, Kawai Y, Rokutanda S, Izumi S, Komori T.
  • Journal Title: Journal of bone and mineral research Volume: 30 Pages: 706-714
  • DOI: doi: 10.1002/jbmr.2379.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Animal models for osteoporosis. (2015)
  • Author(s): Komori T
  • Journal Title: European journal of pharmacology Volume: 759 Pages: 287-294
  • DOI: doi: 10.1016/j.ejphar.2015.03.028.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Microtubule-associated protein tau (Mapt) is expressed in terminally differentiated odontoblasts and severely down-regulated in morphologically disturbed odontoblasts of Runx2 transgenic mice. Cell Tissue Res. in press. (2015)
  • Author(s): Miyazaki T, Baba T, Mori T, Moriishi T, Komori T.
  • Journal Title: Cell and tissue research Volume: - Pages: 印刷中
  • DOI: doi:10.1007/s00441-015-2135-6
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Autophagy-Related Protein 7 Deficiency in Amyloid β (Aβ) Precursor Protein Transgenic Mice Decreases Aβ in the Multivesicular Bodies and Induces Aβ Accumulation in the Golgi. (2015)
  • Author(s): Nilsson P, Sekiguchi M, Akagi T, Izumi S, Komori T, Hui K, Sörgjerd K, Tanaka M, Saito T, Iwata N, Saido TC.
  • Journal Title: The American journal of pathology. Volume: 185 Pages: 305-313
  • DOI: doi: 10.1016/j.ajpath.2014.10.011.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Overexpression of Galnt3 in Chondrocytes Resulted in Dwarfism Due to the Increase of Mucin Type O-glycans and Reduction of Glycosaminoglycans. (2014)
  • Author(s): Yoshida CA, Kawane T, Moriishi T, Purushothaman A, Miyazaki T, Komori H, Mori M, Qin X, Hashimoto A, Sugahara K, Yamana K, Takada K, Komori T.
  • Journal Title: The Journal of biological chemistry Volume: 289 Pages: 26584-26596
  • DOI: doi: 10.1074/jbc.M114.555987.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Cbfb は軟骨細胞分化・増殖および骨芽細胞分化に必要である (2014)
  • Author(s): 秦昕1、松尾友紀、姜晴、森石武史、六反田賢、宮崎敏博、小守壽文
  • Organizer: 第56回歯科基礎医学会学術大会・総会
  • Place of Presentation: 福岡市 福岡国際会議場
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [Presentation] 骨細胞と骨代謝制御 (2014)
  • Author(s): 小守 壽文
  • Organizer: 第32回日本骨代謝学会学術集会（招待講演）
  • Place of Presentation: 大阪市 大阪国際会議場
  • Year and Date: 2014-07-24 – 2014-07-26
  • Invited
• [Presentation] Bcl-2 ノックアウトマウスではAktの不活性化によりFoxOが活性化し、骨芽細胞分化が促進する (2014)
  • Author(s): 森石武史、小守寿人、小守壽文
  • Organizer: 第32回日本骨代謝学会学術集会
  • Place of Presentation: 大阪市 大阪国際会議場
  • Year and Date: 2014-07-24 – 2014-07-26
• [Presentation] Runx2遺伝子の骨芽細胞特異的発現制御機構 (2014)
  • Author(s): 小守寿人、川根徹也、森石武史、高田美生、小守壽文
  • Organizer: 第32回日本骨代謝学会学術集会
  • Place of Presentation: 大阪市 大阪国際会議場
  • Year and Date: 2014-07-24 – 2014-07-26
• [Presentation] Overexpression of Sp7 in osteoblasts inhibits osteoblast maturation but enhances angiogenesis in bone (2014)
  • Author(s): Komori H, Miyazaki T, Yoshida C, Komori T
  • Organizer: ECTS 2014 (European Calcified Tissue Society)
  • Place of Presentation: Prague Congress Centre,Prague,Czech Republic
  • Year and Date: 2014-05-17 – 2014-05-20
• [Presentation] セレンディピティ、Runx2との出会い (2014)
  • Author(s): 小守 壽文
  • Organizer: 第68回NPO法人日本口腔科学会学術集会（招待講演）
  • Place of Presentation: 東京都新宿区 京王プラザホテル
  • Year and Date: 2014-05-07 – 2014-05-09
  • Invited
• [Remarks] 長崎大学細胞生物学分野ホームページ
  • URL: http://www.de.nagasaki-u.ac.jp/dokuji/kaibou-2/