2015 Fiscal Year Annual Research Report
細胞内・細胞外メッセンジャーの生体イメージング法の確立
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26670812
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
谷村 明彦 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (70217149)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
根津 顕弘 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (00305913)
森田 貴雄 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (20326549)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 蛍光センサー / イノシトール三リン酸 / アセチルコリン / FRET / 細胞内シグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、競合的蛍光リガンド・アッセイ法(CFLA法)と、それを応用した競合的蛍光抗原アッセイ法(CFAA法)を確立し、この新しい原理を使ってアセチルコリン（Ach）と IP3 の測定法の開発を試みた。
1)平成26年度の研究で、IP3受容体のリガンド結合ドメインセンサー（LIBRAv2S-Vd）と蛍光アデノフォスチン誘導体の結合によるFRETを利用してIP3濃度を測定できる事が明らかになった。特に親和性を低下させた蛍光アデノフォスチン誘導体を用いて、約3nMのIP3濃度測定が可能になった。また、リガンド結合ドメインの三次元構造に基づいた分子設計によって、FRET反応を増強するCFP連結部位を同定した。
H27年度は、これらの成果を活用したセルフリー・アッセイ系を確立し、IP3濃度の測定が可能であることを実証した。これらによって新しいIP3測定キットの原理が確立した。さらにこの方法を用いて、リガンド結合ドメインに蛍光リガンドと競合的に結合するペプチドの検索に成功した。これによって、細胞内IP3濃度のライブセルイメージングに使用できるセンサー開発の可能性が拓かれた。
2)蛍光センサーおよび測定法方法であるCFLA法とCFAA法の有用性をモデル実験で証明し、新しいアッセイ法の開発における有用性を示した。
3) Achセンサーとしてニコチン性アセチルコリン受容体とニコチン受容体結合ペプチド（F-RVG29-9rR）を使ったセンサーの開発を試みた。ニコチン受容体を発現するSH-SY5Y細胞を使った実験から、F-RVG29-9rRがニコチン受容体に結合して、細胞内に取り込まれることがわかった。一方、F-RVG29-9rRの取り込みはニコチン受容体アンタゴニストのd-ツボクラリンで抑制されなかったことから、F-RVG29-9rRとアセチルコリンが競合しない可能性が高いと考えられた。F-RVG29-9rRを細胞ラベル法に利用できる可能性が示されたが、Achセンサーには適さないことがわかった。
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