歯髄細胞由来TNF誘導因子（DPTIF)受容体の探索研究

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26670824
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 西村 英紀 九州大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (80208222)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 讃井 彰一 九州大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (70507780) ; 福田 隆男 九州大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (80507781)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 歯髄細胞 / マクロファージ / TNF-alpha / 歯髄炎症

Outline of Annual Research Achievements

歯髄細胞が産生し、マクロファージからのTNF産生を誘導する因子について探索するため、同因子を有すると考えられる活性を有する不死化歯髄細胞、初代培養歯髄細胞で活性のない歯肉由来線維芽細胞に比べ発現が亢進している遺伝子群の網羅的解析を行ってきた。不死化歯髄細胞と初代培養歯髄細胞で共通して発現亢進した遺伝子に注目し、組換タンパクを入手し、活性の確認を行った。一部の遺伝子産物で活性が確認されたため、中和抗体を用いた阻害実験を行い、阻害が確認された後に、同タンパクと結合するマクロファージ由来タンパクを受容体候補タンパクとして同定する予定であった。しかしながら、用いた抗体で阻害がかからなかったことから以下の通り理由を考察した。①抗体のqualityが阻害実験を行うにあたり充分でない可能性、②活性の確認に用いた組換タンパクの純度が低く、内毒素などが混入している可能性。
そこで、遺伝子発現解析に加え、プロテオーム解析を用いて目的とする因子の同定を試みることとした。不死化歯髄細胞を無血清状態で培養し、培養上清を回収した。回収した上清にマクロファージからのTNF産生誘導能があることを確認した後に、質量分析を用いたタンパク発現解析を行った。上清中にユニークなタンパク断片が確認されたため、遺伝子発現解析結果と併せ、再度組換タンパクもしくはノックダウンにより活性を確認する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初、遺伝子発現解析によって得た情報をもとに、組換タンパクを入手し、目的の活性を確認したと考えた。しかしながら中和抗体による阻害実験やノックダウンによって活性の低下を見なかった。組換体に内毒素などが混入した結果と考えられた。そこで新たにプロテオーム解析を追加し、遺伝子発現解析結果とあわせ解析を行うこととした。

Strategy for Future Research Activity

プロテオーム解析、遺伝子発現解析結果に基づき、再度活性物質の同定を試みる。最終的に市販の抗体で阻害実験を行う際、抗体のqualityに多分に結果が左右されるため、ノックダウンによる活性の消失確認により同定を進めることとした。すでに系は確立しており、候補分子の絞り込みを行ったため、早急に同定を進める予定である。