2015 Fiscal Year Research-status Report

歯根膜恒常性維持機構としての細胞内ロジスティクスの役割とその制御

Research Project

Project/Area Number	26670887
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	春山直人九州大学, 大学病院, 講師 (70359529)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	寺尾文恵九州大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (10510018) 安永敦九州大学, 歯学研究科(研究院), 研究員 (80515990) [Withdrawn]
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	歯学 / オートファジー / 歯根膜 / 歯の移動 / メカニカルストレス / 細胞死
Outline of Annual Research Achievements	矯正学的な歯の移動において、歯根膜線維芽細胞には、メカニカルストレスが負荷されるのみならず、血流変化による低酸素や栄養不足に曝されることから、細胞の生存・恒常性維持のメカニズムがダイナミックに変化すると考えられる。本研究課題では、歯根膜線維芽細胞において、細胞が飢餓に陥ったときや、虚血などの病的状態によって誘導される恒常性維持機構としてのオートファジーに着目しその詳細な役割を検討することである。本年度は、昨年までに確立した歯根膜線維芽細胞を用いたin vitroの実験系において、細胞に機械的伸展力・圧縮力を付加しオートファジーが誘導されるか否かを確認し、オートファジー関連タンパクの発現の経時的変化を定量した。また、生体の歯根膜において特異的にオートファジーを欠失させることで、オートファジーの役割を解析するためにPostn-Creを用いた遺伝子改変マウスを作成する予定であったが、その前段階であるPostnのプロモーター配列について機能解析を試みた。さらに、生体内においてオートファゴゾームの形成が行われているか否かについて、GFP-LC3 マウスにおける歯の移動を超弾性コイルによって行い、歯周組織におけるオートファゴソームの形成を確認するとともに、低酸素プローブを腹腔内注射することで、歯周組織に形成された低酸素部位との局在の関連を組織切片上で確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度は、1)種々の刺激に暴露した際の歯根膜細胞のオートファジーの動態の解析、2) 歯周組織特異的オートファジー欠損マウスの作成と歯の移動実験を予定していた。 1)種々の刺激に暴露した際の歯根膜細胞のオートファジーの動態の解析については、昨年までに基礎的な実験系は確立させていたため、本年はその解析を順調に進めることができた。 2) 歯周組織特異的オートファジー欠損マウスは、Postnプロモーターの機能解析が予定よりも遅れ、今年度までに歯周組織特異的オートファジー欠損マウスを作出することができていない。他方、予定していたGFP-LC3 マウスを用いた歯の移動実験は予定通り進める事ができた。よって、実験内容によって、計画通り進捗している部分と遅れている部分があるものの、全体としては概ね順調であると判断した。
Strategy for Future Research Activity	前年度よりおこなってきたGFP-LC3マウスにおける歯の移動実験を継続し、歯根周囲組織におけるオートファジーに影響をあたえる因子についてより詳細に解析する。歯の移動実験から、歯根膜内で一定量の細胞死が起きていることが判明したことから、細胞死がオートファジー性であるか否かを、死んだ細胞におけるオートファジーのマーカー蛋白LC3 の発現、電子顕微鏡によるオートファゴソームやオートリソソームの数や大きさを評価することで確認する。さらに、アポトーシスの各種マーカー（カスパーゼ３活性化、核クロマチンの凝縮、アポトーシス小体の形成など）、ネクローシスの各種マーカー（細胞体、核、ミトコンドリアなどのオルガネラの膨化、細胞膜の破綻、細胞質のオルガネラの流出など）も、マウスの歯根膜組織構造の解剖学的変化とあわせ免疫組織学方法・電子顕微鏡学的方法で検討する。当初の研究計画にあった、Postn-Cre TGマウスを独自に作出し、期間内にAtg5flox/flox マウスと交配し歯周組織特異的にオートファジーを欠損したマウスを作出することは時間的に困難になる可能性がある。また、本年になって海外においてPostn-CreTGマウスを利用した論文が初めて報告された。今後は、より基盤的な研究につなげるため、海外から上記マウスを入手し利用することを検討する。また、Atg5を in vitroにおいてノックダウンし、in vivoの状況を再現した実験系を計画・遂行することで、海外からの動物入手が困難な場合でも一定の所見を得られるよう工夫をする予定である。
Causes of Carryover	研究を進めていく上で必要に応じて都度研究費を執行していったため、消耗品使用量に当初の見込とわずかな違いが生じたことが、今年度所要額と実支出額の間に総額の約0.6%の差が生じる理由となった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	今年度使用が少なかった分の消耗品は次年度購入が必要となるため、今後の研究計画に軽微な変更はあるものの、次年度において今年度の研究費も含めた使用を計画している。