大脳皮質視覚野における同一神経幹細胞由来機能相同性配列の発達の解析

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26710002
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 大槻 元 京都大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (60723278)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: クローン細胞 / 遺伝子改変マウス / 大脳皮質 / 一次視覚野 / 生体下Ca2+イメージング / ３次元位置機能解析 / 機能発達

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、大脳一次視覚野において由来する幹細胞を同一にする神経細胞群で機能発達の仕組みを解明する。その際、二光子顕微鏡による生体内でのCa2+神経活動記録と脳スライス標本下の神経細胞群からの多電極パッチクランプ記録により、クローン細胞間のシナプス伝達と可塑性誘導、およびそれに対する投射を調べ、機能構造の発達過程を明らかにする。本年度も、幼若期と成体での機能類似性がどのように変化するのかを明らかにするために、機能と細胞位置の数値解析および得られた情報の評価を行った。
研究計画に立案した仮説１）『幼若期と成熟期のクローン細胞群で機能の類似性の違い』について、引き続き検討した。蛍光タンパク標識されたクローン細胞群について、二光子顕微鏡観察で得たデータを解析したところ、幼若期と成体のクローン細胞群で方位選択性に違いがあり、幼若期から成熟期にかけて機能の類似性が下がることがわかった。さらに３次元的位置解析を進めたところ、クローン細胞群の中でも、幼若期に大脳皮質内で30um半径の円柱領域で縦方向に並んだクローン細胞の機能が特に似ていることが明らかになった。発達に従って、その様な縦状に並ぶ機能的類似性は緩く解消されることがわかった。縦方向の機能領域の検討ののち、横方向並んだクローン細胞群、環状領域にあるクローン細胞群の方位選択性の類似度も検討したところ、縦方向に比べて類似度の違いは見られなかった。今後も、何故、縦方向に位置する幼若期のクローン細胞同士の機能類似性が特に高く、成体では類似性が下がるのかを追求し、シナプス結合と投射様式を調べる。
また、クローン細胞集団は幼若期には水平方向に反応しやすく、発達が進むにつれて水平と垂直方向への反応性を獲得することも分かった。最適方位の分布の発達に伴う変化について、情報量基準（AIC/BICなど）をもとにグラフフィッティング評価を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

二光子顕微鏡による生体下イメージングで得た、幼若期と成体のクローン細胞の視覚機能（方位選択性）に関する大規模データを解析した。細胞の大脳皮質内での3次元的位置を数値解析によって正確に求め、蛍光標識されたクローン細胞群を同定した。解析結果が妥当であるか検討を続け、データ評価についても多くの手法を試した。現在、研究結果をまとめ、論文投稿準備中である。
仮説１）の成果発表に至っていないので、仮説２）３）を進めにくい状況にあるが、大脳皮質一次視覚野のクローン錐体細胞からの複数細胞からの同時記録を試み、我々の用いている遺伝子改変動物でもシナプス結合確率が高いという予備データも得た。その過程で、４細胞同時パッチクランプ記録にも成功した。また、外側膝状体からの一次視覚野クローン細胞群への投射を調べる目的で、蛍光物質注入を試みた。しかしながら、蛍光標識した投射軸索を脳切片標本下で電気刺激するのではなく、外側膝状体細胞にチャネロドプシン遺伝子を注入し光刺激をすることで、クローン細胞群への共有投射を調べることも試したいと考えている。クローン細胞間のシナプス可塑性誘導については、錐体細胞間の結合確率が低いので、成功率が低く、限られた時間内で達成することが難しい。現在、任期のある雇用に就いているので、実験手技の高さを求めることに終始する課題や、結果の得にくい実験に多くの時間を費やせない。
京都大学に異動してから、当大学での企画（白眉プロジェクト）も始まり、微生物内毒素による神経興奮性可塑性に関する研究が大幅に進行した。いずれも私単独の研究であり、実験解析を要領よく行うなどの最大限の工夫をしているが、どうしても時間が逼迫している。現状では、本科研費での仮説２）３）は、本年度中には完成させられないと感じている。しかしながら、白眉プロジェクトとして研究を継続させ、特に仮説３）の計画は完成させたい。

Strategy for Future Research Activity

今後は、まず仮説１）に関する論文発表をしたい。また研究計画で挙げた、仮説２）『幼若期と成熟期とで、大脳皮質内でのクローン細胞群への結合様式に違いがあり、発達にともなってシナプス結合が変化する。』、および、仮説３）『幼若期で、大脳皮質外からの外側膝状体側枝がクローン細胞群毎に特異的に投射する。』の検証も引き続き行う。何故、近傍に位置するクローン細胞同士の機能が特に幼若期において類似性が高く、成体では類似性が低いのかを、シナプス結合を調べることで明らかにする。特に仮説３）では、幼若期に互いの円柱領域近傍に位置するクローン細胞の視覚機能が似ているといった、これまでに明らかになった事実を踏まえて、幼若脳のクローン細胞とその近傍の細胞の結合と外側膝状態からの投射に共有があるか否かを調べ、成体脳のそれと比較する。その際、大脳皮質切片標本からの多重同時パッチクランプを行う。外側膝状態からの投射を刺激する際、蛍光標識した投射軸索を脳切片標本下で電気刺激するのではなく、外側膝状体細胞にチャネロドプシン遺伝子を注入し光刺激をすることで、クローン細胞群への共有投射を調べることも試したい。

Causes of Carryover

前年度未使用額は34,420円となったが、使用計画範囲内で使用するように心掛けた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度予算として、不測の支出、実験動物の購入、試薬、ウイルスの購入に充てる。